多种质粒提取方法

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1、从从细细菌菌中中分分离离质质粒粒 D DN NA A 的的具具体体操操作作材材料料、设设备备及及试试剂剂一、材料 含 PBS 的 E.coliDH5 或 JM 系列菌株， 1.5ml 塑料离心管（又称 eppendorf 管），离心管架。 二、设备 微量取液器（ 20l，200l，1000l），台式高速离心机 ，恒温振 荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅）， 涡旋振荡器 ，电泳仪，琼脂糖平板 电泳装置和恒温水浴锅等。 三、试剂 1、LB 液体培养基（ Luria-Bertani）：称取蛋白胨（ Tryptone） 10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于 800ml

2、 去离子水中， 用 NaOH 调 pH 至 7.5，加去离子水至总体积 1 升，高压下蒸气灭菌 20 分钟。2、LB 固体培养基：液体培养基中每升加 12g 琼脂粉，高压灭菌。 3、氨苄青霉素（ Ampicillin，Amp）母液：配成 50mg/ml 水溶液，- 20保存备用。 4、溶菌酶溶液：用 10mmol/LTrisCl（pH8.0）溶液配制成 10mg/ml， 并分装成小份（如 1.5ml）保存于-20，每一小份一经使用后便予丢弃。 5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml 水中溶解 40.81gNaAc3H2O，用冰醋 酸调 pH 至 5.2，加水定容至 100ml，分装后

3、高压灭菌，储存于 4冰箱。 6、溶液 1:50mmol/L 葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0）， 10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶 100ml，高压灭菌 15分钟，储存于 4冰箱。 7、溶液：0.2mol/LNaOH（临用前用 10mol/LNaOH 母液稀释）， 1SDS。 8、溶液：5mol/LKAc60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O28.5ml，定容至 100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为： K+3mol/L，Ac5mol/L。 9、RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/LTrisCl（pH7.5），

4、15mmol/LNaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于 100加热 15 分钟，使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5mleppendorf 管分装成小份保存于 -20。 10、饱和酚：市售酚中含有醌等 氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键 的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联，应在 160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加 入 0.1的 8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的 0.5mol/LTrisCl（pH8.0）和 0.1mol/LTrisCl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH 值达到 7.6 以上，因为酸性条件下 DNA 会分配于有机相。11、氯仿：按氯仿：异戊

5、醇 24：1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白 变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡 沫。按体积/体积1：1 混合上述饱和酚与氯仿即 得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 12、TE 缓冲液：10mmo/LTrisCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。 高压灭菌后储存于 4冰箱中。 13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTrisCl（pH8.0）， 10mmol/LEDTA（pH8.0），5%TritonX-100。 14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTrisCl（pH8.0）

6、， 1mmol/LEDTA（pH8.0）。 15、电泳所用试剂：（ 1）TBE 缓冲液（5）：称取 Tris54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至 1000ml。（2）上样缓冲 液（6）：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。 操操作作步步骤骤一、细菌的培养和收集 将含有质粒 pBS 的 DH5 菌种接种在 LB 固体培养基（含 50g/mlAmp）中，37培养 12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到 5mlLB 液体培养基（含 50g/mlAmp）中，37振荡培养约 12 小时至对数 生长后期。 二、质粒 DNA 少量快速提取 质粒 D

7、NA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所 得 DNA 有一定纯度，可满足 限制酶切割、电泳分析的需要。 （一）、煮沸法 1、将 1.5ml 培养液倒入 eppendorf 管中，4下 12000离心 30 秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于 120mlSTET 溶液中，涡旋混匀。 4、加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液（ 10mg/ml），涡旋振荡 3 秒钟。 5、将 eppendorf 管放入沸水浴中， 50 秒后立即取出。 6、用微量离心机 4下 12000g

8、离心 10 分钟。 7、用无菌牙签从 eppendorf 管中去除细菌碎片。 8、取 20ml 进行电泳检查。 注意1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑 取单个菌落直接进行煮沸法 提取质粒 DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度， 浓度高时，细菌裂解效 果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。 3.提取的质粒 DNA 中会含有RNA，但 RNA 并不干扰进一步实验 ，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反 应等。 （二）、碱法 1、取 1.5ml 培养液倒入 1.5mleppendorf 管中，4下 12000g 离心 30 秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于

9、 100l 溶液中（需剧烈振荡），室温下放置 5-10 分钟。 4、加入新配制的溶液 200l，盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5 分钟。 5、加入 150l 预冷的溶液 ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡 10 秒，使沉淀混匀，冰浴中 5-10 分钟，4下 12000g 离心 5-10 分钟。 6、上清液移入干净 eppendorf 管中，加入等体积的酚 /氯仿（1:1）， 振荡混匀，4下 12000g 离心 5 分钟。 7、将水相移入干净 eppendorf 管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，振荡 混匀后置于-20冰箱中 20 分钟，然

10、后 4下 12000g 离心 10 分钟。 8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入 1ml70乙醇洗沉淀一次， 4下 12000g 离心 5-10 分钟。 9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10 分钟 或室温干燥。 10、将沉淀溶于 20lTE 缓冲液（pH8.0，含 20g/mlRNaseA）中， 储于-20冰箱中。 注意1.提取过程应尽量保持低温。 2.提取质粒 DNA 过程中除去蛋白 很重要，采用酚 /氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 3.沉淀 DNA 通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长 可使 DNA 沉淀完全

11、。沉淀 DNA 也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完 全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。 （三）、Wizard 少量 DNA 纯化系统 Promega 公司的 Wizard 少量 DNA 纯化系统可快速有效的抽提质粒 DNA，整个过程只需 15 分钟。提取的质粒可直接用于 DNA 测序、酶切分析 和体外转录等。该系统中所含试剂和柱子可以用于50 次 1-3ml 质粒培养液 的分离和纯化，试剂包括 10ml 细胞悬浮液， 10ml 细胞裂解液； 10ml 中和 液，50mlWizard 少量 DNA 纯化树脂， 50ml 柱洗液（使用前加 95%乙醇至 120ml）和 50

12、支 Wizard 微型柱。 1、1-3ml 过夜培养细胞液 4下 12000g 离心 1-2 分钟。 2、去除上清液，菌体细胞悬浮于 200l 细胞悬浮液中，充分混合， 并移入 eppendorf 管中。 3、加 200l 细胞裂解液，颠倒离心管数次，直到溶液变清亮。 4、加 200l 中和液，颠倒离心管数次。 5、4下 12000g 离心 5 分钟，取上清液于新的 eppendorf 管中。 6、加 1mlWizard 少量 DNA 纯化树脂，颠倒离心管数次以充分混匀。 7、取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒与 Wizard 微型柱连接， 用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使

13、混合物进入微型柱。8、将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加 入 2ml 柱洗液，并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。 9、取出微型柱置于 eppendorf 管中，离心 2 分钟以除去微型柱中的柱 洗液。 10、将微型柱放在一个新 eppendorf 管中，加 50lTE（或水）于微型 柱中，静止 1 分钟后，4下 12000g 离心 20 秒。 11、丢弃微型柱，将 eppendorf 管中的质粒 DNA 贮于 4或-20冰箱。注意树脂使用前应充分混匀，如有结晶，可将树脂用25-37水浴 处理 10 分钟。 三、质粒 DNA 的大量提取和纯化 在制作酶谱、测定序列、制备探

14、针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒 DNA，为此需要大量提取质粒 DNA。大量提取的质粒 DNA 一般需进一步纯化， 常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法 1、取培养至对数生长后期的含 pBS 质粒的细菌培养液 250ml，4下 5000g 离心 15 分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于 50ml 用冰预冷的 STE 中（此步可省略）。 3、同步骤 1 方法离心以收集细菌细胞。 4、将细菌沉淀物重新悬浮于 5ml 溶液 I 中，充分悬浮菌体细胞。 5、加入 12ml 新配制的溶液 II，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次， 以充分混匀内容物，冰浴 10

15、 分钟。6、加 9ml 用冰预冷的溶液 III，摇动 离心管数次以混匀内容物，冰上放置15 分钟，此时应形成白色絮状沉淀。 7、4下 5000g 离心 15 分钟。 8、取上清液，加入 50mlRNA 酶 A（10mg/ml），37水浴 20 分钟。 9、加入等体积的饱和酚 /氯仿，振荡混匀， 4下 12000g 离心 10 分钟。10、取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀， 4下 12000g 离心 10 分钟。 11、取上层水相，加入 1/5 体积的 4mol/LNaCl 和 10%PEG（分子量 6000），冰上放置 60 分钟。 12、4下 12000g 离心 15 分钟，沉淀用数 m

16、l70%冰冷乙醇洗涤， 4 下 12000g 离心 5 分钟。 13、真空抽干沉淀，溶于 500mlTE 或水中。 注意1.提取过程中应尽量保持低温。 2.加入溶液 II 和溶液 III 后操 作应混和，切忌剧烈振荡。 3.由于 RNA 酶 A 中常存在有 DNA 酶，利用 RNA 酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理（ 801 小时），使 DNA 酶失活。 （二）、Wazard 大量 DNA 纯化系统 碱法大量提取 DNA 往往需要很长的时间 .Promega 公司的 Wiazrd 大量 DNA 纯化系统既简单又快速，只需要离心和真空抽干，这个系统可以从 500ml 培养液中在 3 小时以内获得 1mg 以上的高质量的质粒 DNA（200- 20000bp）。该系统不需要酚和氯仿抽提，纯化后的DNA 溶于水或 TE 缓冲 液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA