二恶英检测分析方法比较

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1、二恶英检测方法比较二恶英化合物（简称二恶英）是剧毒有机污染物。人体长期低剂量接触，会导致 癌症、雌性化、胎儿畸形、糖尿病等疾病。自比利时发生二恶英食品污染事件和 POPs 公约在瑞典斯德哥尔摩签署以来，二恶英检测与污染防治在国际上受 到越来越广泛的关注 1 。二恶英检测属超痕量、多组分检测，对特异性、选择 性和灵敏度要求极高，被认为是当代化学分析领域的一大难点。美国较早开展二恶英检测研究，现已制定出一系列的检测标准。欧洲和日本也相继研究和制定了二恶英检测标准方法。我国目前正处于二恶英基础研究的起步阶段，尚未提出相关检测标准和方法，因此亟待建立符合我国国情的二恶英检测方法和体系。2 二恶英检测方

2、法2.1 化学仪器分析方法在 200 余种异构体中分离出17 种有明显毒性的二恶英，分别测定其浓度或含量。将浓度或含量乘以每种二恶英的毒性因子（TEF ）就可以得到总毒性当量（TEQ ）。该方法的一般程序包括采样、提取、净化、定性定量。2.1.1 采样样品的取样量由样品类型、污染水平和方法的检测限而定。各国对采样程序都单独编制了标准方法。2.1.2 提取为了测定提取净化效率和校正分析丢失，首先加入17 种 13C PCDD/Fs采样内标和37Cl2,3,7,8TCDD 净化内标。溶剂选择和提取步骤取决于样品类型和净化方法，如在处理废弃物焚烧飞灰时溶剂选取石油醚/ 甲苯 / 二氯甲苯，在处理脂肪

3、样品时溶剂选取二氯甲烷/ 己烷。提取步骤一般包括溶解、振荡、 混匀和萃取。 索氏萃取是传统的提取方法，广泛应用于检测飞灰、鱼、牛乳和脂肪组织样品中的二恶英。目前，超临界流体萃取装置（SFE ）、加压加热型的高速溶剂萃取装置（ASE ）和微波萃取方法也用于提取样品中的二恶英，并有大量对比实验证明了这些方法的有效性3,4。2.1.3 净化为了除去大量干扰物质，目前大多采用色谱法进行净化。色谱法通常将分配处理柱和色谱柱串联使用，包括酸或碱处理、硅胶柱、氧化铝柱、佛罗里柱和活性炭柱的二次净化，具体操作因样品类型和基质性质而异。目前，一些实验室正在开发一次性多层柱（如微型氧化铝柱）和 HPLC净化方法来

4、简化净化过程。净化后要加入15 种 13CPCDD/Fs定量内标和2 个 13C标记的用于确定色谱保留时间的内标5 。2.1.4 定性定量通常定性检测采用2 类不同极性的色谱柱。首先用非极性或弱极性固定相将氯原子取代数相同的二恶英化合物分为1 组，然后用极性固定相分离其中的异构体，最后通过对17 种标记的和未标记的标准样品实施比较，获取保留时间。定量检测主要采用选择离子监测技术（SIM），以 13C稳定同位素为内标，根据测量目的用质量校正程序校正质谱模式、分辨率（M/?M=10,000 以上， 10谷峰）等，并储存质量校正结果。对氯不同取代程度的异构体分别定量。仪器可选择高分辨质谱仪（HRMS

5、 ）、四级杆低分辨质谱仪（LRMS ）。2.2 生物学检测方法目前建立的生物学检测方法均是通过对 Ah 受体活化程度的测定来间接表达二恶英的TEQ 。2.2.1 EROD 细胞培养法二恶英与Ah受体结合活化后，被Ah 受体核转位因子 （ ARNT ）转移到细胞核内，活化的核内基因是特异性DNA片段即二恶英响应因子（DRE ）。启动发挥毒性的基因并增加其转录，从而激活 EROD 酶的活性。 所以通过测定EROD 酶的活性， 可以了解二恶英激活Ah受体的能力，进而获得测试样品中二恶英的 TEQ6 。2.2.2 萤光素酶方法该方法是将萤火虫萤光素酶作为报告基因结合到控制转录的DRE上， 制备成质粒载

6、体并转染H4IIE 大白鼠肝癌细胞系（含Ah受体传导途径的各个部件）。以此构成的CALUX 系统萤光素酶诱导活性与二恶英的毒性系数相对应，最终测定的结果也是TEQ6 。2.2.3 EIA 酶免疫方法该方法是根据鼠单克隆抗体DD3与二恶英结合的特点而建立的竞争抑制酶免疫方法。使用酶竞争配合物 （HRP ）和样品中二恶英共同竞争有限的DD3抗体的特异性结合位点, 以一系列不同浓度的 2,3,7,8TCDD 为标准物质， 作出 2,3,7,8-TCDD标样与对应样品的剂量效应曲线，样品中二恶英毒性强度以计算出的TCDD 毒性等价浓度间接表示。最终通过测定DD3与HRP螯合物的荧光强度来获取二恶英的T

7、EQ 。螯合物的荧光强度与二恶英的TEQ成反比 7 。2.2.4 DELFIA荧光免疫法DELFIA（Dissociation-enhancement Lanthanide Fluoro Immunoassay）法属于时间分辨荧光免疫分析法。 该方法利用生物基因技术选择出合适的抗原键合铕离子与样品中二恶英竞争单克隆抗体， 待免疫反应完全后加入荧光增强液, 使铕离子从抗原中解离下来，进入增强液 ,形成胶束，高效地发出荧光。螯合物最终用时间分辨荧光法分析，其荧光强度与二恶英的TEQ成反比 8 。3 二恶英检测方法分析比较3.1 化学仪器检测目前， HRGC/HRMS法是被认可的二恶英标准检测方法，

8、如美国的 EPA 1613 方法 和日本工业用的 JIS K0311方法。它们具有检测灵敏度高和能同时检测多个离子 等优点，但所要求的样品前处理过程非常复杂，导致检测成本上升，一般检测1 个样品需要 900 1800美元。检测工作只能在少数专业化程度较高的实验室中 进行，而建造二恶英专业检测实验室一般需要投资数百万美元以上。所有这些不 利因素都制约着对二恶英开展大规模、大范围的低成本检测与研究。在实际检测过程中， 使用 GC/HRMS 法可保证灵敏度， 简化前处理步骤， 缩短检测 时间，降低检测成本， 但仍需在专业实验室中完成；使用 HRGC/LRMS法可极大降 低在检测仪器方面的投入，但当每

9、克样品中二恶英浓度低于pg/g 水平时，却无 法获得可靠的检测结果。 因而 HRGC/LRMS法仅适用于检测二恶英浓度较高的污染 源样品和污染较重的土壤样品。例如，美国的EPA 8280方法可检测出土壤、底 泥、飞灰和燃油等样品中含48 个氯的二恶英化合物，不能用于检测如食品等 二恶英含量较低的样品。3.2 生物学检测 目前生物学检测方法主要用于对二恶英样品的定量筛选。研究表明，EROD 法具 有较好的准确性和较宽的线性范围， 但测得的样品 TEQ略高于使用标准方法获得 的结果 。萤光素酶方法在牛乳样品二恶英检测实验中，与标准方法相比在检测 结果方面比较一致， 说明该方法可用于食品样品的二恶英

10、毒性检测。上述都属于 细胞培养法， 检测时需要配制各种浓度的细胞试液，一般化学实验室不具备这样 的条件。而且培养时间长达24h，整个检测过程需要数日，不能满足快速检测的 要求1 。此外， EIA 酶免疫方法与标准方法相比，测得的TEQ 值也比较一致， 但灵敏度比较低。DELFIA法是一种最新的二恶英检测方法, 由于不需要细胞内诱导活化过程，体外 活化时间仅需 2h，因此 1 个批次样品检测可在8h 内完成，极大地提高了检测效 率。使用铕标记抗原 , 采用时间分辨荧光技术 , 可以消除非特异性荧光的干扰， 使 免疫方法的灵敏度大大提高。 由于灵敏度的提高， 检测所需试样量少， 因此降低 了检测成

11、本。一般 1 个样品的平均检测成本仅 10 15美元。同时，该方法对实 验条件要求不高， 大部分检测工作均可在常规实验室甚至现场完成，无需建造专 业实验室的高成本投入，适于对大批量样品实施快速定量筛选。4 结论与建议 以 HRGC/HRMS法为代表的化学仪器分析方法具有检测灵敏度高、选择性好、特异 性强等优点，但其样品前处理过程比较复杂，对实验条件的专业化程度要求高， 检测时间长，检测成本高，因而具有一定的应用局限性， 主要用于样品规模较小、 精度要求较高的专门检测。 与其相比， 生物检测方法的前处理过程比较简化，样 品检测时间短、 检测成本低， 对实验条件的专业化程度要求不高，但是其检测灵

12、敏度和精确度相对稍差，比较适用于大批量二恶英样品的快速定量筛选。目前，我国的食品和环境安全正日益受到二恶英污染的威胁。因此应结合实际需 要，在满足降低成本、提高效率的前提下，综合利用各种检测方法的优势，尽快 建立起能够满足定量筛选、 常规检测和认证分析等不同要求、符合我国国情的多 层次分级二恶英检测体系。 在该体系内， 低成本、快速的生物检测方法可应用于 一般食品检测和环境监测， 如定量筛选大规模的污染源样品等。而一般的化学仪 器分析包括 GC/HRMS 法和 HRGC/LRMS法，可应用于对筛选出的样品进行较高精 度的检测。 最后，可以通过建立几个符合国际标准的二恶英专业检测实验室，完 成对

13、二恶英检测的权威认证分析工作，这对推动我国的二恶英基础研究和污染防 治工作将起到积极的作用。5 参考文献 1 吴永宁 , 王绪卿 . 二恶英极其类似物对环境与食品污染. 中国食品卫生杂 志,1999,11 （5）: 27 33. 2 田洪海 , 全浩. 固体废弃物焚烧处理中二恶英的排放. 环境科学研究 ,1998,11 （3）: 5 7. 3 Malisch R, Metschies M. Development of analytical methods for determination of dioxins. Advantages of tritium labeled TCDD nd c

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15、a-er lake area in China: Results on residual levels nd correlation to the organic carbon nd the particle size. Chemo-sphere., 1997, 34（1）:191202. 6 袁倬斌，李珺 . 二恶英类分析研究进展及展望. 分析化学评述进展 .2001, 29 （10）:1222 1227. 7 黎雯, 徐盈, 吴文忠，等. 利用 EIA 生物测试法快速定量筛选环境样品中的二恶 英污染物 . 环境科学 ,2000,21 （4）:69 72 8 常文保 , 王敏灿 , 张柏林，等. 稀土螯合物探针及其在时间分辨荧光免疫分析中 的应用 . 大学化学 ,1997,12 （1）:1 6.