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1、文件名称大肠菌群检测作业标准书页 次1/4 文件编号YSMD/ZJ/ZY-01版 次A/01.目的：为保证原、辅料以及产品中的微生物指标之大肠菌群符合公司生产、客户以及国 家的标准，确保产品不会对消费者健康造成影响；特制定本标准书。2.范围本标准书适用于对原、辅料以及半成品、成品的大肠菌群的检验3.权责检验员负责实验的全过程的操作4.术语大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞 杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质 量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。5
2、.操作方法5.1仪器：5.1.1冰箱：0-4 5.1.2恒温培养箱：361 5.1.3架盘药物天平：0g500g,精确至0.5g 5.1.4显微镜：10-100 5.1.5灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度） 5.1.6灭菌锥形瓶：500 mL 5.1.7灭菌培养皿：直径90mm5.1.8灭菌试管：16mm160mm5.1.9灭菌刀、剪子、镊子、载玻片、酒精灯、试管架等。5.2药品 5.2.1乳糖胆盐发酵管：按GB 4789.28-2003中4.9规定。文件名称大肠菌群检测作业标准书页 次2/4 文件编号YSMD/ZJ/ZY-01版 次A/05.2.2伊红美蓝琼
3、脂平板：按GB 4789.28-2003中4.25沥规定。 5.2.3乳糖发酵管：按GB 4789.28-2003中4.10规定。 5.2.4EC肉汤：按GB 4789.28-2003中4.11规定。 5.2.5磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28-2003中3.22规定。 5.2.6 0.85%生理盐水。 5.2.7革兰氏染色液：按GB 4789.28-2003中2.2规定。 5.3检验程序大肠菌群检验程序如下：检样稀释乳糖胆盐发酵管361， 242h不产气 产气 大肠菌群阴性 伊红美蓝琼脂平板361， 18-24h报告革兰氏染色 乳糖发酵管361， 242h革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽孢
4、杆菌 产气 不产气大肠菌群阴性 大肠菌群阴性报告 大肠菌群阳性 5.4操作步骤文件名称大肠菌群检测作业标准书页 次3/4 文件编号YSMD/ZJ/ZY-01版 次A/05.4.1检样稀释 5.4.1.1以无菌操作将检样25mL(或g)放于含有225mL灭菌生理盐水灭菌玻璃瓶内 ，经充分振摇或研磨做成110的均匀稀释液。 固体检样最好用均质器，以8 00010000r/min的速度处理1min，做成110的均匀稀释液。 5.4.1.2用1mL灭菌吸管吸取110稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他 稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1100的稀释液。 5.4.1.3另取1mL灭菌吸管，按
5、上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次 ，换用1支1mL灭菌吸管。 5.4.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每 个稀释度接种3管。 5.4.2乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发 酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置361 温箱内，培养242h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群 阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 5.4.3分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361温箱内，培养182 4h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和
6、证实试验。 5.4.4证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发 酵管，置361温箱内培养242h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染 色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 5.4.5报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN 值。5.5粪大肠菌群(faecal coliform)5.5.1用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见7.2条)转种于EC肉汤管内，置44.50.2水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面)，培养242h，经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性；如有产气
7、者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置361培养1824h，凡文件名称大肠菌群检测作业标准书页 次4/4 文件编号YSMD/ZJ/ZY-01版 次A/0平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值， 5.5.2结果报告表1大肠菌群最可能数(MPN)检索表5.6检验过程严格按照进行无菌操作，并注意安全5.7实验结束后作好实验室的卫生清洁以及及时、准确的填写相应的记录6.相关文件6.1成品质量标准6.2 GB/T4789.3-20037.相关记录7.1产品检验报告7.2原辅料检验单7.3
8、微生物检测原始记录表1阳性管数95%可信限1Ml(g)*30.1Ml(g)*30.01Ml(g)*3MPN100 Ml(g)下限上限000000000123303060905900000111101233060901205130000022220123609012016000003333012390130160190111100000123407011015051020021011111111012370110150190103023036011220111015030360112223200240111133330123160200240290222200000123901402002601
9、03036037022221111012315020027034030704408902222222201232102803504204010047015002222333301232903604405303333000001232303906409504070150120013003800333111012430750120070140300210023003800313160033332222012393015002100290015030035038004400470033333333012324004600110002400036071015001300024000480003.2.7注:本表采用3个稀释度1Ml(g)、0.1Ml(g)和0.01Ml(g)，每个稀释度3管。表内所列检样量如改用10Ml(g)、1Ml(g)和0.1Ml(g)时，表内数字应降低10倍；如改用0.1Ml(g)、0.01Ml(g)和0.001Ml(g)时，则表内数字应增加10倍。其余可类推。
