制药工程基础实验实验

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1、1实验一、培养基的配置与微生物的接种培养实验实验一、培养基的配置与微生物的接种培养实验（一）实验目的：通过实验，使学生了解和掌握培养基的配置、消毒方法和接种与培 养技术。了解微生物对营养物质的需求，不同微生物的生长差异。 （二）实验原理：微生物必须在含有所需要的营养元素的培养基上才能生长，不同种类的 微生物有它所适宜生长的培养基，细菌和真菌的培养基不同，在长期的实践中形成了有些 著名的培养基配方和配置方法。微生物的培养过程中要防止其他微生物的存在和生长，因 此在接种和培养过程中要进行灭菌和消毒，防止杂菌的干扰。灭菌方式中广泛使用的是蒸 汽灭菌，即湿热灭菌。是热灭菌的好处是灭菌效果好，因蛋白质在

2、含水时易变性，另外蒸 汽穿透力大，含能量高。使用蒸汽灭菌器要注意排气完全，否则达不到灭菌温度。表 1 表 示排空气程度与实际温度的关系。 表 1 蒸汽灭菌其中空气排除程度与器内温度的关系空气排除程度表压力（kPa）灭菌器内的实际温度（）完全排除98.07121排除 2/398.07115排除 1/398.07112排除 1/398.07109完全未排除98.07100蒸汽灭菌器的压力有的以 1b/in2（磅/英寸2） 、kg/cm2表示，现统一以帕（Pa）或千帕（kPa）表示，它们与温度的关系如表 4-2。 表 2 蒸汽压力与温度的关系蒸汽压力kPaLb/in2Kg/cm2相应温度 （）34.

3、4750.352107.768.95100.703115.5103.42151.055121.6137.90201.406126.6172.37251.756130.5206.84302.109134.4表 3 糖在不同温度下热灭菌的破坏情况灭菌方法103.42kPa(121)68.9582.74kPa(115.6118)55.1668.95kPa(113115.6)10015min20min20min30min分析方法糖名 （10%糖液）含量% 破坏 %含量 %破坏 %含量 %破坏 %含量% 破坏 %旋光法葡萄糖 乳糖 麦芽糖 蔗糖76.0 67.9 94.0 87.724.0 32.1 1

4、6.0 12.381.8 85.7 84.7 97.718.2 14.3 15.3 2.399.4 95.3 86.5 98.70.6 1.4.7 2.13.5 3.1.392.0 81.9 78.8 96.38.0 18.1 21.2 3.7表 4 一些微生物杀死的温度与时间微生物热死时间微生物热死时间2温度时间 min温度时间 min脆弱假单胞菌 氯针假单胞菌 荧光假单胞菌 赛氏杆菌（低温性） 海产弧菌（低温性） 鼠伤寒沙门氏菌50 60 53 30 25 5535 10 25 30 80 10*伤寒沙门氏菌 桑夫顿伯格沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 结核杆菌 产气肠细菌60 63 6

5、0 61 47 505 6* 7 530 30 60*指活菌数减少一个对数级即 90%被杀死所需的时间。 蒸汽灭菌适用范围很广，但主要是培养基的灭菌。在培养基灭菌中最需注意不要过多 破坏营养，特别是糖类。糖类在湿热灭菌时破坏情况见表 3。（三）实验材料 1.大肠杆菌、红豆杉内生真菌。 2.生化培养箱。 3.超静工作台 3.接种环或无菌牙签。 4.酒精灯。 5.无菌培养皿。 6.肉汤培养基 牛肉膏0.5g水100ml 蛋白胨1.0gPH7.2 NaCl0.5g 加入 1.2琼脂，即为固体完全培养基（CM） 。7.PDA 培养基：PDA）： 马铃薯煮汁100 毫升 蔗糖 2 克 琼脂1.5 克 P

6、H 值5.56.0制法：先将新鲜无病害的马铃薯洗净，去皮后切成小薄片，称 20 克，加水100 毫升，煮沸 20 分钟后过滤，其滤汁为马铃薯煮汁。然后加琼脂和蔗糖煮溶，后补足水分至 100 毫升，装培养皿灭菌备用。（四）操作步骤 1 按上述要求配置 2 种培养基，分别装入培养皿； 2 放入高压锅中蒸汽灭菌 20min。 3 待培养基冷却凝固后，在两种培养基上分别接种大肠杆菌和红豆杉内生真菌。37培养。42 天后检查生长情况。3（五）实验结果与讨论 1如何保证灭菌效果？ 2 不同种类的微生物菌落形态有何差异？ 3 如何为微生物选择合适的培养基？实验二、微生物的显微镜观察实验二、微生物的显微镜观察

7、 （一）实验目的：通过实验使学生了解显微镜的结构和使用方法，了解和掌握微生物 的染色技术。 （二）实验原理： （三）实验材料 1.菌种 大肠杆菌，红豆杉内生真菌。 2.染色液 草酸铵结晶紫染液；蕃红液。 3.器具 显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，载玻片。 （四）操作步骤 1.将固定好的涂片加滴结晶紫 1min，若干了，还要补加染料。 2.用缓冲流水去染料。 3.加蕃红液复染 30s。 4.用缓冲流水冲去。 5.用洗水纸吸干，直接用显微镜观察，先用低倍镜观察，然后用油浸镜观察，作图。（五）染色操作步骤及注意点 染色法可以看到染色操作包括制片、固定、染色、媒染、脱色、复染、水洗、干燥等 步骤，每一

8、步都具有其操作要点和注意点，若不当心，可能就得不到满意的结果。 1. 制片 制片要采用干净的载波片，并注意接种环的无菌操作。做斜面菌体片时，要 防止菌体和水混和不均匀有团结现象，注意菌体量适中。 2. 固定 涂片后最好先在室温下自然干燥，然后固定。固定的目的是：（1）杀死微 生物，固定其细胞结构；（2）保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，因而可以防止标本被冲 洗掉；（3）改变菌体对染料的通透性，一般使死细胞原生质染色。 固定常用高温。手执载波片一侧，标本面朝上，在火焰外层快速来回通过 34 次。共 约 34s，要求玻面温度不超过 60，此时以手背皮肤接触不觉过烫为度，放置待冷后染 色。由于热固定改

9、变细胞的内部结构及外形，所以研究菌体细胞结构时常采用化学固定法。常用的化学固定剂有：95酒精、酒精和醚 1：1 的混和液、丙酮、12锇酸溶液。 适用于固定丝状菌的固定液介绍两种：（1）铬酸-醋酸-锇酸液：铬酸 1g，冰醋酸 1g，1 锇酸 1ml。 （2）铬酸-醋酸-福尔马林液：1铬酸 80ml，冰醋酸 5ml，福尔马林 15ml。 锇酸能很快固定细菌细胞而不改变其结构，因此用它来固定微生物细胞很方便。 3. 媒染与染色 标本固定以后，滴加染色液，使整个标本固定在染色液中。染色时间 视标本与染色的性质而定，有时还需加热。一般染色时间为 13min。 如作复合染色，要在染色前作媒染处理。媒染剂与

10、染料能形成不溶性的化合物，它能 增加染料和细胞的亲和力（表 3-2） 。媒染一般在固定后进行，但也可结合固定或染色同时 进行。 5. 水洗与干燥 染色时间一到，就应用细小的缓流水将多余染料从标本上洗去，但不 会将细胞所吸附的染料洗去。洗净后，将标本置桌上风干，也可用吸水纸轻轻吸去水分。4有时也可微微加热，待干后再镜检。 6. 标本玻片的封藏 标本镜检后，有时需要长期保存，这是应将标本封存。常用的制 片粘着胶是加拿大胶，其制法是：混和等量的干加拿大胶和碳酸氢钠在乳钵内磨碎，加入 等量二甲苯，制成透明溶液，约一星期后过滤，并微热，使溶液具适当稠度。保存在暗处， 并外涂黑色。将此液滴加到标本中，上盖

11、清洁盖玻片，压平，待干，保存。用此种中和性 的加拿大胶保藏标本，较不易褪色。 （六）实验现象与分析实验实验 3- 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、实验目的：掌握聚丙烯酰胺凝胶的配置，电泳仪的使用，蛋白质聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离的原理与方法。 二、原理 二、原理原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳按其电泳装置和凝胶的形状可分为垂直管型盘状电泳和垂直板型 电泳。二者的操作原理和操作方式基本相同，不同的是前者在圆玻璃管内将凝胶做成圆柱 状，后者在两块平板玻璃之间将凝胶做成平板状。聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶的组成系统可分成四种：（1）连续凝胶电泳：只用一层凝胶，采用相同的 pH 值和相同

12、的缓冲液。（2）不连续凝胶电泳：采用二层或三层性质不同的凝胶（即：样品胶、浓缩胶和分离 胶）重叠起来，使用两种不同的 pH 值和不同的缓冲液。（3）梯度凝胶电泳：采用梯度混合装置，使制得的凝胶由上至下孔径逐渐减小（即凝 胶浓度由上至下逐渐增高） 。梯度凝胶电泳主要适宜于测定球蛋白的相对分子质量。（4）SDS-凝胶电泳：在聚丙烯酰胺凝胶中加入 SDS（十二烷基硫酸钠 Sodium Ddecyi Sul- fate） 。A.聚丙烯酰胺凝胶的制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acrylamiae）和交联剂 N，N 一甲叉双丙烯酰胺 （N，N-methylene bisacrylamide，简称 B

13、IS）在催化剂的作用下聚合而成的。所用的催化剂有两种：用过硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMED）作为化学聚合催化剂。 在 TEMED 或其他叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基。氧的自由基又使丙烯酰胺 形成自由基，从而引发聚合作用。用核黄素（vitb2）作为光聚合的催化剂。光聚合可用 日光、日光灯或电灯作为光源。在痕量的氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基再 被氧氧化形成自由基，从而引发聚合作用。 在聚丙烯酰胺凝胶制备时，改变单体丙烯酰胺的浓度可使凝胶网状结构中网眼的孔径 改变。因此可根据被分离物质的相对分子质量大小选择适当的浓度。交联剂 N，N-甲叉双 丙烯酰胺的浓度对孔径也有一些影响。当

14、丙烯酰胺的总浓度不变时交联剂的浓度占 5， 则凝胶孔径最小；高于或低于 5，孔径都相对变大。一般使用时交联剂与单体浓度之比 为 25：100。B.不连续电泳中样品压缩成层的原理不连续电泳使用二层或三层不同孔径的凝胶，使用不同的 pH 和缓冲液，能使稀样品 在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。不连续电泳的凝胶由上至下可分为：（1）样品胶：为大孔径凝胶，在 pH6.76.8 的 Tirs-HCl 缓冲液中聚合而成，含有欲 分离的样品。有时可不用这一层样品胶，而直接将样品液加入 10甘油或 520蔗糖5后，加在浓缩胶的表面。（2）浓缩胶：在 pH6.76.8 的 Tris-HCl 缓冲液中聚合而

15、成的大孔径凝胶。除了不含 样品外，其他与样品胶相同。样品就是在浓缩胶中浓缩，按迁移率的不同，在浓缩胶与分 离胶的界面上压缩成层的。（3）分离胶：在 pH8.88.9 的 Tirs-HCl 缓冲液中聚合而成的小孔径凝胶。样品组分 在分离胶中进行电泳和分子筛分离。连续电泳时只用一层分离胶即可，其制备方法相同。当不连续电泳的多层凝胶重叠在一起，用 pH8.3 的 Tris-甘氨酸缓冲液置于电泳槽内进 行电泳时，样品就在浓缩胶中浓缩成狭窄的高浓度样品层。这是因为在各层胶中都含有 HCl，HCl 离解度大，几乎全部成 Cl-。Cl-在电场中泳动最快（迁移率最大） ，称为快离子。 而电泳槽中含有甘氨酸，在

16、样品胶和浓缩胶中 pH 为 6.76.8，甘氨酸只有 0.l1.0解 离为 CH2（NH2）COO-，在电场中迁移率最小，泳动速度最慢。而蛋白质的泳动速度介乎 快离子与慢离子之间。它们的有效迁移率（有效迁移率为迁移率 m 与解离度 a 的乘积）按 下列顺序排列：mcacmPaPmGaG（C 为 Cl-，P 为蛋白质，G 为甘氨酸） 。当电泳开始后， 作为快离子的 Cl-很快超过蛋白质，走在最前面，而使其后面形成一个离子浓度较低的低电 导区。低电导产生较高的电位梯度，这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速 移动，致使蛋白质在快、慢离子之间被浓缩成一狭窄的中间层。当这一浓缩成层的样品带进入分离胶时，因分离胶的 pH 为 9.5（配制分离胶时 pH 为 8.88.9，但在电泳过程中，根据测定结果 pH 实为 9.5） ，使甘氨酸的解离度增加，泳动速 度加快，很快地超过所有蛋白质。高电位梯度消失，使蛋白质在均一的电位梯度和 pH 的 条件下电泳分离。加上分离胶