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1、在实验性注射黄杆菌冷菌后三种鲑的病理学和免疫组织化学在实验性注射黄杆菌冷菌后三种鲑的病理学和免疫组织化学 摘要摘要 为了评估黄杆菌的易感性在不同物种之间的差异, 研究人员对虹鳟鱼，虹鳟（walbaum） ，海鳟，褐鳟，大西洋鲑，进行了实验。此外，还对病理变化和内脏器官中的细菌分布的差异进行了研究。在腹腔注射两个不同剂量：高剂量（HD）1 107 菌落形成单位（CFU）鱼）和低剂量（LD）1 106 CFU 鱼）1 细菌。LD 组的死亡率介于 0 和 7.5之间，HD 组在 55-70之间不等。记录的死亡率在同种物种之间没有太大的区别。按照虹鳟鱼鱼苗综合征的临床症状和病理反应，三种物种在这两点上
2、是很相似的。虹鳟鱼与其他物种相比，其脾脏的病变更明显。肾小管上皮细胞及造血组织坏死最突出的是虹鳟和大西洋鲑。在虹鳟和鳟鱼的肾小管上皮细胞内滴嗜酸性粒细胞两者很幸存的没有被感染。用免疫组化研究发现分布在内脏器官的细菌存在三种相似。关键词关键词：病理学，免疫组织化学，大西洋鲑鱼，黄杆菌，虹鳟鱼，海鳟鱼，易感性引言引言细菌性疾病（BCWD）和虹鳟鱼鱼苗综合征（RTFS）病，在世界许多地区的水产养殖地都有发生 (Holt 1987; Bernardet, Baudin-Laurencin Wakabayashi, Horiuchi, Bunya Bustos, Calbuyahue, Montan,
3、Opazo, Entrala Wood Shimadzu ScientifiInstruments Inc., Columbia, MD, USA）为 525 nm 和调整，以吸光度与 PBS0.4，相应的浓度大约 2108 菌落形成单位（CFU）1。串行稀释和三联体接种在 TYES 琼脂（伴有.琼脂的 TYES 肉汤）进行悬浮液中活菌数量的估计。红鳟鱼的鱼苗 (平均重量 0.740.2 g)，大量的鲑鱼 ( 平均重量 0.70？0.1 g) 和大西洋的鲑鱼 ( 平均重量 0.760.1 g) 被分别分配给五组，每个组有 40 条鱼。在用浓度为 10mgL 的碳酸盐缓冲液 MS 222 麻醉
4、后 ( Sandoz Ltd， Basel，瑞士 ) ，在每条鱼腹膜内 (i.p.) 注射 0.05 mL 的细菌悬液。在注射了 1 106 CFU 鱼两个地计量组（）和注射了 1106CFU 的鱼1 两个高剂量组（Hd）重复操作该免疫性试验。一个高剂量组的两条海鳟在注射后的两天死亡，把这两条鱼排除在该研究之外。每个注射了 PBS 的鱼种类中的每一组作为对照组。死亡率和大体病理死亡率和大体病理每天至少记录疾病的死亡率和临床症状3到6次。死亡的和濒死的鱼被检查作为大体病理的研究结果并把它们作为细菌学和形态学研究的样本。作为细菌学研究样本的鱼一般不会用于形态学研究。当所有剩下的鱼被MS222麻醉、
5、采样用于细菌和形态学研究之前被杀死的21天，该实验宣告结束。细菌学细菌学用塑料循环把细菌样品从肾脏中取出，并把它放在TYES琼脂和5马血琼脂上。TYES琼脂在15下培养10天，血琼脂在20下培养7天。为了得到表型特征，TYES琼脂上的黄色的菌落被进一步培养，来确保黄杆菌冷菌可以从病鱼身上再次分离出来。表型特征适用于所有从感染的鱼分离出来的细菌，48h后的菌落和细菌型态，过氧化氢酶(30% H2O2)，和细胞色素氧化酶的生产（Bactidrop氧化酶，Remel，美国） ，柱状曲桡型色素（20%KOH）,在6和30的TYES琼脂肉汤上生长，并在APIZYM渠道反应。组织病理学组织病理学组织病理学
6、的研究标本被固定在10福尔马林磷酸缓冲（pH值7.2-7.4）。鉴于有引起验尸报告的变化的可能，晚间死亡的鱼被排除在组织病理学研究之外。把鱼苗的头和身体分开并分别用石蜡包裹，放入切片，并用苏木精和曙红染色（H Bruno 1992; Rangdale, Richards Rangdale et al. 1999)。与海鳟相比，虹鳟和大西洋鲑鱼在肾脏肾小管上皮细胞和造血组织病变坏死方面表现得更为明显。肾脏的退行性变化包括坏死，已在银大麻哈鱼(Wood Evensen Lorenzen 1994)。这种病变可能是因为在肾小球蛋白质的泄漏以及随后在肾小管上皮细胞的蛋白质摄或在吸收蛋白质的透明变性的肾
7、小管上皮细胞的细胞干扰。 在三种病鱼的肝细胞中均发现有糖原耗尽的现象。这可能是由于细菌内毒素的扩散引起的。内毒素诱导的肝细胞糖原耗竭，已在银大麻哈鱼原代肝细胞接触到大肠杆菌和鲑气单胞内(Wedemeyer,Ross Madsen Madsen,Arnbjerg Ostland, McGrogan Lorenzen 1994; Decostere, Lammens Garcia, Pozet Madetoja, Nyman & Wiklund 2000).。图7显示了免疫组化染色，多克隆黄杆菌黄杆菌螺菌抗体的ABC -方法 ，AEC作为显色，迈尔氏苏木精明矾的反染色染剂。死/垂死的鱼在高剂量组。
8、（a）大量的细菌，概述了椎骨（箭头）（鳟鱼）（栏中0.05毫米）。（b）染色阳性的巨噬细胞（箭头）和自由的细菌（箭头指向）在脾的薄壁组织（鳟鱼）（栏中0.05毫米）。（c）染色阳性的内皮细胞（箭头）和巨噬细胞在肾脏肾小管周围毛细血管（虹鳟鱼）（箭头）（栏中= 0.01毫米）。（d）染色阳性的肾小球和巨噬细胞在肾脏（大西洋鲑）的造血组织（箭头）（栏中0.05毫米）。（e）染色阳性的内皮细胞（箭头）和巨噬细胞（箭头）在肝脏毛细管（虹鳟鱼）（栏中0.05毫米）。 （f）染色阳性的内皮细胞（箭头）和在心脏的心房（大西洋鲑）（栏中0.05毫米）循环中的吞噬细胞（箭头指向）。总之，在这项研究中记录虹鳟鱼，
9、海鳟鱼和大西洋鲑对黄杆菌螺菌感染的易感性没有太大的差别。尽管在当前的病理表现上有些差异，但三种鱼还是生出一种相同的，类似于RTFS的败血性疾病，而且细菌在内脏器官中也有着相似的分布。致谢致谢感谢Ellen Lorenzen博士, rhus, Denmark 提供的抗体。感谢sa Gessbo 和Christina Nilsson 高超的的筹备组织切片和免疫组化染色能力。该项研究是由瑞典农林研究（SJFR）理事会的支持下进行的。参考文献参考文献Bernardet J.F., Baudin-Laurencin F. & Tixerant G. (1988) First identification
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