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1、流式细胞仪原理结构及应用流式细胞仪原理结构及应用流式细胞仪原理结构及应用流式细胞仪原理结构及应用 流式细胞仪简介流式细胞仪简介流式细胞仪简介流式细胞仪简介 流式细胞仪是进行流式细胞分析的仪器，集电子、计算机、激光、流体理论于一体，被誉为试验室的CT 。 流式细胞术（Flow CytoMeter, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。 工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室
2、，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和 90方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度
3、或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过 AD 转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其 X 轴为测量强度，Y 轴为细胞数 目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有 512 或 1024 通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据， 既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体
4、视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 应用范围 用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开始用于细菌鉴定，病毒感染细胞的识别和爱滋病感染者 T4、T8 细胞的记数。 70 年代以来，随着流式细胞技术水平的不断提高，其应用范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿 瘤
5、学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。 技术特点 流式细胞仪作为一种先进的细胞定量分析检测仪器，设计上采用了许多独特的技术，其中涉及到液流系统、光路系统、信号测量和细胞分选等 4 个方面。 展望 流式细胞仪从细胞技术开始发展到今天，60 至 70 年代是其飞速发展时期，激光技术、喷射技术以及计算机的应用使流式细胞仪在原理和结构上形成了固定的模式。 80 年代则是流式细胞仪的商品化时期，这期间不断有新型号的仪器推出，在多参数检测技术上不断提高。 进入 90 年代，随着微电子技术特别是计算机技术的发展，流式细胞仪的功能也越来越强大。在数据管理、数据分析方面有了长足进步。
6、但是，在技术原理和设计方面并没有突破性的进展。人们的注意力开始转向流式细胞仪的应用，新的荧光探针、新的 荧光染料、新的染色方法不断推出，使流式细胞技术在新的细胞参数分析方面日益发展。 从新推出的仪器看，流式细胞仪会在硬件上不断更新，采用更新的器件（如半导体激光、大规模集成电路） ，以实现小型化；用数字电路取代模拟电路，充分发挥微处理器的功能以实现简单化；在软件上提高数据自动分析能力，充分发挥图形界面的优点， 使操作更加简便。 流式细胞仪的技术指标与主要构造流式细胞仪的技术指标与主要构造流式细胞仪的技术指标与主要构造流式细胞仪的技术指标与主要构造 流式细胞仪主要由以下五部分构成:流动室及液流驱动
7、系统激光光源及光束形成系统光学系统信号检测与存储、显示、分析系统细胞分选系统。 ? 主要技术指标主要技术指标主要技术指标主要技术指标 1流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测 1000 5000 个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2 流式细胞仪的荧光检测灵敏度： 一般能测出单个细胞上90%病例 CD10+，而婴儿 CD10+病例95%，PNH 病人 CD55、CD59 明显减少，这种减少不仅表现在红细胞上，粒细胞、淋巴细胞也有减少。已发现 CD55c 可能对 GPI 减少或缺乏较 CD59 更敏感。 ? 血液学应用血液学应用血液学应用血液学应用： 血小板功能分析和血小板病诊断血小板功
8、能分析和血小板病诊断血小板功能分析和血小板病诊断血小板功能分析和血小板病诊断 （一） 血小板功能分析 血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同，用不同的抗血小板单克隆抗体可测定 和 分 析 血 小 板 功 能 状 态 。 血 小 板 质 膜 糖 蛋 白 单 克 隆 抗 体 CD41(GPIIb/IIIa) 、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小板颗粒膜糖蛋白 CD62p、CD63的测定可供分析血小板功能状态，如 CD62p、CD63 正常血小板不表达，当
9、血小板活化时表达明显增加，可用来测定活化血小板。 （二）血小板病诊断攪 1血小板相关抗体测定 血小板相关抗体可因不同机制产生。抗血小板自身抗体(包括原发性、药物诱导产生、合并其它自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮)能引起严重的血小板减少。大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体 PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相关抗体的抗原仍不十分清楚,可能有多种,如GPb、GPb 、GPa、Pa、或HLA 抗原。抗血小板自身抗体也可能发生于多次输血后或怀孕期间 , 这些自身抗体多为针对 HLA-类抗原决定簇的抗体,一般是 IgG,它们可迅速破坏和清除
10、随机供血者的血小板。因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必需的。许多不同的利用放免、荧光、酶、SPA 等的测定血小板抗体的方法已建立,但这些方法都很复杂、费时;同时给出的结果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗体来表示。近年来发展起来的用 FCM 测定血小板抗体的方法具有快速、 简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中FCM 分析每一个血小板表面有无抗体,能给出血小板群体中有多少血小板表面有抗体(以%表示); 同时能给出血小板相关抗体量与血小板数的直方图, 使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况。 FCM 测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人 IgG、I
11、gA、IgM 或用抗血小板 GPb、b、b/a 的抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常O 型血小板作用后用 FCM 测定,前者测定的是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体。 2血小板无力症 血小板无力症时血小板膜 GPIIb/IIIa 明显减少，用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体 CD41、CD61 和流式细胞仪测定不仅可测出 GPIIb/IIIa 减少，CD42a、CD42b 基本正常或偏高，还可测出 GPIIb/IIIa 减少程度，分类血小板无力症。 3.巨大血小板综合征（BSS）:血小板巨大, CD42a 减少，CD42b 减少，CD61 增加。 ? 血液学应用血液
12、学应用血液学应用血液学应用：微小残留白血病检测微小残留白血病检测微小残留白血病检测微小残留白血病检测 微小残留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病经治疗后获得完全缓解(Complete Remisson CR) 后体内残留少量白血病细胞的状态。 微小残留白血病与明显白血病(Overt leukemia)无明确界限, 仅是白血病细胞负荷数量不同,一般成人明显白血病时白血病细胞可达 1012,经治疗获 CR 后1010, 因此 MRL 状态白血病细胞数可能是 100-10 攪。MRL是白血病复发的根源,因此检测MRL有十分重要的意义: 指导临床治疗预测白血
13、病复发评价自体骨髓移植的净化效果。应用FCM 检测 MRL 的优点在于可在短时间内分析大量标本,具有快速的特点。 由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM 检测 MRL 的效果尚不理想,敏感性尚不够高，一般仅有 1/103-104。目前主要有两类检测方法: 用FCM 分析 CR 期骨髓细胞核酸量或染色体,可用于部分 AL 病人 MRL 分析,但敏感性仅 1-5%。 免疫表型分析,由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量的差别及分布部位的不同作为检测依据;如利用 TdT 和 CD10 双标记检测 MRL,但敏感性亦不高,约 0.1-1%。 假阴性结果可能由于: 标本中的白血病细胞1
14、0-4 攪或10-5;所取标本不能代表全身骨髓情况; 病人白血病细胞表型转换。 ? 血液学应用血液学应用血液学应用血液学应用：白细胞吞噬功能测白细胞吞噬功能测白细胞吞噬功能测白细胞吞噬功能测定定定定 粒、单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员。它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生物、肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取、修饰、递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的。因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义。 以下简要介绍FCM 测定白细胞吞噬功能的概况。 应用光学显微镜、荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒、单核细胞
15、, 并尽可能地保持细胞活性。用 FCM 检测时不须分离细胞,应用全血即可, 因此可在自然状态下测定,结果准确可靠。 目标粒子一般以酵母、细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者为 FITC(异硫氰酸荧光素)或 RA(罗达明). 以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用 EDTA),200l 全血与目标粒子 200l(目标粒子浓度4107/ml)置 37 C 温育,温育结束后立即置冰水中, 以同样标本不在37 C 温育而置于冰水中者作为对照。 目标粒子不同温育时间不一,FITC 标记的金黄色葡萄球菌 25 分钟,FITC 标记的粒子 15 分钟即可达到吞噬饱和;此外
16、,粒子与白细胞的比例也很重要,一般为 10:1。温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测。 应用 FCM 全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失、损伤最小; 此外用本法可测定血清中的调理素(Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子。如果用 FITC 标记的单克隆抗体 CD13、CD14、CD15 标记粒、单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作进一步的研究。 ? 血液学应用血液学应用血液学应用血液学应用：NK 和和和和 LAK 细胞活性测定细胞活性测定细胞活性测定细胞活性测定 NK 细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC 限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人 NK 细胞一般表达CD56、CD16、
