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1、PCR 检测常见问题与解决途径利用 PCR 方法检测转基因成分时，经常出现假阳性 、假阴性 、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR 检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的PCR 方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。本文对 PCR 检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验中的几个阴性对照中
2、出现一个或几个阳性结果 ，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR 试剂的污染：主要是由于在PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染。3. PCR 扩增产物污染：这是PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR 产物拷贝量大 (一般为 1013 拷贝 /ml)，远远高于PCR 检
3、测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR 产物污染，就可形成假阳性。4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力 ，其污染可能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。（三）假阳性问题的试验控制在每次 PCR
4、 检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA 提取（ RNA 提取、 RNA 反转录）、 DNA 扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。只有设立试验全程的对照，才能证明试验结果成立。造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括：1、DNA 阳性对照：以含有目的片段的DNA( 或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。（注意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其成为潜
5、在的污染源）。2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。4、PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA ，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA 中存在 PCR 抑制物。5、空白提取对照 ：空白提取对照扩增结果为阳性，说明 DNA 提取试剂可能受到污染。6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。如果 DNA 阳性对照扩增结果为阴性， 或者 DNA 阴性对照和空白对照扩增结果为阳性，则说明 PCR 试剂或扩增过
6、程存在问题。（四）假阳性解决途径由于PCR 的敏感性和效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性 。尤其是 PCR 扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。1、规范实验室设计实验室设置上分配液区、DNA 提取区、扩增区、电泳区。物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序，严禁倒流。在连续而独立的空间中完成不同实验步骤。不同工作区域相互隔离，通过传递仓传递。PCR 前处理区（样品制备室、DNA 提取室）和PCR 准备室设置正压通风系统，并设置通风柜或生物反应柜造成局部负压；后PCR 室（PCR 室及电泳室为高度污染区）设置负压通风系统，防止大量游离分
7、子及气溶胶，对其它区域造成环境污染。配制 PCR 反应体系（配备冰箱及生物安全柜，此实验室要求无模板DNA 存在）和向PCR 反应体系中加入模板DNA （配备生物安全柜及冰箱）要求在不同区域进行。2、规范试剂耗材管理1）验证：新购买的试剂需进行实验前验证；2）分装：双蒸水、引物和dNTP 均应分装储存，并标明日期，以防污染；试剂的分装应在装有紫外灯的超净工作台上进行；试剂分装成小份一次使用后弃去。3）消毒：除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。必要时，在加样本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。3、规范实验室操作1）控制污染源：PCR产物和质粒操作空间是最大的污染源
8、，应严格防止将这个空间的物品带出；2）一次性用具：使用实验服和一次性手套，使用带有滤膜的移液器枪头，一次性反应管和离心管；3）定期消毒：定期对实验室进行紫外照射，用10% 漂白剂、 3双氧水或专用商业产品清理实验室台面及死角。4）定期通风：对实验室定期进行正压、负压通风处理；5）小心操作：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；加样时，最后加阳性对照。4、技术处理1）在DNA 模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR 产物。一般选用波长254nm 照射30min （ Nature ， 1990 ， 34:27 ）；2） PCR 实验中使用dUTP ，而不用
9、dTTP 。在扩增前使用UraciI N 一 g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）处理可降解交叉污染的PCR 产物，而不降解基困组DNA 模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（Gene ，1990 ，93：125）。美国PE 公司提供此类试剂盒；3）在 PCR 反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联DNA 链，使之不能再扩增（Nucleic Acids Res，1991 ，19 ：99）。二、假阴性（一）假阴性现象与判断方法如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。但这里应注意，许多国产PCR 试剂盒中阳性对照采用质粒DNA ，
10、和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。设置内标准基因对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中同时对内标准基因对照进行扩增，若内标准基因对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。（二）造成假阴性的原因1 仪器因素PCR 实验对仪器的依赖性是很高的，离心机、扩增仪都是造成PCR 假阴性的因素。扩增仪的主要问题是孔间差，引起扩增失败或扩增效率降低。而离心机的影响则更容易被忽视。国内使用离心机很少使用离心加速度（XXXg ）作为参数指标，而常使用转数作为参数指标，这里就存在着一个问题，由于离心机的大小
11、不同，有效跳心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大(有的在数倍以上)，所以在相同的离心时间下，有可能模板并没有离心下来，造成PCR 假阴性。这个问题在其他实验也有，但因其他实验都是测定大分子蛋白沉淀， 对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题。2 试剂质量问题PCR 实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽提；引物位点的选择；Taq 酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR 试剂非常重要。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是
12、否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为： 选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长
13、期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。3 核酸模板问题1）模板中含有杂蛋白质；2）模板中含有Taq 酶抑制剂；3）模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；4）在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；5）模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。4、物理原因： PCR 仪控温不准，也是PCR 失败的原因之一。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪内的变性、退火和延伸温度。5、靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物
14、与模板失去互补序列，其PCR 扩增是不会成功的。6 操作人员素质问题PCR 实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。（三）假阴性问题的试验控制在每次 PCR 检测时，一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明试验全部过程的试剂没有受到污染；阳性对照样品检测为阳性时，表明DNA 提取（ RNA 提取、 RNA 反转录）、 DNA 扩增和电泳鉴定工作体系正常。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下，才能对检测样品进行判定。造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。试验对照包括：1、
15、DNA 阳性对照：以含有目的片段的DNA( 或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。（注意：阳性样品扩增效率高，应严格控制，避免其成为潜在的污染源）。2、DNA阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。3、空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。4、PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样品DNA ，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA 中存在 PCR 抑制物。5、空白提取对照 ：空白提取对照扩增结果为阳性，说明 DNA 提取试剂可能受
16、到污染。6、阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。如果 DNA 阳性对照扩增结果为阴性， 或者 DNA 阴性对照和空白对照扩增结果为阳性，则说明 PCR 试剂或扩增过程存在问题。（四）假阴性解决方案1反应体系不灵敏：1）检查PCR试剂是否失效；2）检验引物是否降解：3）优化PCR 扩增体系与程序。2、PCR 反应存在抑制物： （1）稀释模板DNA，进行扩增分析； （2）纯化模板DNA ，除去蛋白质、多酚、多糖等抑制物；（3）检测 PCR 体系中是否含有扩增抑制物。3、DNA 提取失败： 1）选择与优化样品DNA 提取方法； 2）验证 DNA 提取试剂是否失效。三非特异扩增（一）现象PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，(二）原因：1. 引物设计与浓度问题引物设计：引物碱基的G+C 含量以 40-60% 为宜， G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两
