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1、一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性一个新的具有特殊结构和潜在趋化活性的人细胞因子趋化素样因子的人细胞因子趋化素样因子 1 的克隆和特性研究的克隆和特性研究韩韩文玲文玲 娄雅欣娄雅欣 唐唐军军民民 张颖张颖妹妹 陈陈英玉英玉 马马大大龙龙 等等细胞因子是在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。近年来，越来越多的细胞因子得以发现。本文介绍一种新的细胞因子趋化素样因子 1（CKLF1）的发现和特性研究。CKLF1 全长 cDNA 序列包括 530个碱基，有一个编码 99 个氨基酸的完整开放读码框架。CKLF1 与已发现的其它细胞因子没有明显的序列同源性。CKLF1 在 PHA 刺激的 U937
2、细胞中的表达可被 IL-10 所部分抑制。重组的 CKLF1 能够明显趋化嗜中性细胞、单核细胞和淋巴细胞，同时，它能够刺激小鼠骨骼肌细胞的增殖。以上结果表明 CKLF1 可能在炎症和骨骼肌再生过程中发挥重要作用。关键词：白细胞介素 10；骨骼肌细胞；剪切；抑制性减数杂交前 言细胞因子是一群在免疫和炎症反应中起重要作用的小分子蛋白质。总的来说，细胞因子在细胞被活化后呈一过性诱导表达，其表达受多种因素调控。细胞因子包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等（1）。其中，趋化因子是结构相似的小分子蛋白质，在吸引和活化白细胞过程中起重要作用。趋化因子在蛋白质水平上含有 4 个保守的半胱氨酸，根
3、据前两个半胱氨酸的相对位置不同，趋化因子可分为CXC（） 、CC（） 、C（）和 CX3C（）4 个亚家族，C 代表半胱氨酸，X 代表任一氨基酸（2）。以前的研究表明：人前单核细胞系 U937 细胞在 PHA 刺激下，能够产生多种细胞因子；而白细胞介素10 能抑制多种细胞因子的产生（3） （4）。基于以上研究结果，我们设计了一条新的技术路线来发现新的细胞因子。利用抑制性减数杂交技术，从 PHA 刺激的 U937 细胞中克隆到能被 IL-10 所抑制的 cDNA 序列，其中一个序列编码一个新的分泌性细胞因子，含有 CC 家族趋化因子所具有的特征性结构即两个连续的半胱氨酸，并对多种白细胞具有趋化作
4、用，该因子被命名为趋化素样因子 1（CKLF1） 。但是，该因子与其它 CC家族趋化因子有如下区别：（1）CKLF1 成熟蛋白质只有一个连续的 CC 结构，其羧基端没有其它的半胱氨酸；（2）CKLF1 与已发现的其它 CC 家族趋化因子没有明显序列上的同源性； （3）CKLF1 至少存在其它三种不同的 RNA 剪切形式；（4）它对骨骼肌细胞有刺激作用。CKLF1 可能代表一个新的家族的趋化因子。因此，我们将其命名为趋化素样因子 1，其相应的变异体命名为 CKLF2，CKLF3 和 CKLF4。材 料 和 方 法抑制性减数杂交（SSH）SSH 的操作方法按 Diatchenko 报道的进行操作(
5、5)， 用 CLONTECH 公司的 PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit。SSH 技术把抑制性 PCR(Suppression PCR)和传统的减数杂交方法相结合(16)，可用于比较两个群体的 mRNA，得到在一组 mRNA 中表达，而在另一组 mRNA 中低表达或不表达的基因。先将 mRNA 反转录为 cDNA，其中含有特异表达基因的样本为 tester，另一组为 driver，tester 和 driver cDNA 杂交，去除杂交体 cDNA，没有形成杂交体的 cDNA 即是在 tester 中特异表达或高表达的基因，而在 driver 中不表达或低表达
6、的基因。抑制性 PCR 在选择性扩增特异基因的同时，抑制自身的扩增，使杂交阳性率更高。在 SSH 操作过程中，人前单核细胞系 U937 细胞由本室长期传代培养。细胞培养在含 10%胎牛血清 ，100U/ml 青链霉素的 RPMI1640 培养基中。用于 SSH 操作的 U937 细胞批量培养至 2107细胞，离心收集细胞, 用 Hanks 液洗三遍后悬于含 10ng/mlPHA 的 10% FCS RPMI1640 中, 其中一半即 1107细胞作为tester, 另一半细胞中加入终浓度为 100ng/ml 的 IL-10 作为 driver。继续培养 8 小时后收集细胞， 提取 mRNA，取
7、 2gmRNA 合成双链 cDNA，用 RsaI 切后，将 tester 分为两组，在 T4 DNA 连接酶作用下，分别连上 Adapter1 和 Adapter2，进行两轮杂交，杂交产物用作 PCR 扩增的模板。将杂交产物稀释 1000 倍，利用试剂盒提供的 PCR 引物，进行第一轮 PCR，扩增 27 轮，然后将第一轮 PCR 产物稀释 10 倍，分别以NESTED PCR 引物 1 和 NESTED PCR 引物 2R 进行第二轮 PCR，扩增 15 轮，得到的扩增产物即为差异基因片段，Glassmilk 回收 2001600bp 的片段，克隆到 pGEM-T easy 中，连接产物转化
8、 XL-Blue 菌，选白色克隆。得到约 100 个克隆，随机筛选 15 个变大明显的克隆，纯化质粒 DNA，用 ALF 快速测序仪进行序列分析，并在 NCBI 中进行序列同源性比较。生物信息学将来自 PHA 刺激的 U937 细胞文库的 EST 片段与 GenBank TBLASTN 的 EST 数据库进行比较。将与CKLF1 片段有高度同源性的序列（50 个以上碱基，95%以上同源性） ，通过 EST Assembly Machine (http:/www.tigem.it). 进行 EST 拼接（6）。用于 CKLF1 拼接的 EST 片段的登记号为 W38899, N95062, AA
9、429945, AA987264, AA927461, W19056, N89912, AA516431, AA479657, AA455042, AA989129, AF151058，NM-016951，W52820。在 PHA 刺激的 U937 细胞中得到 CKLF1 的全长序列，测序证明 EST 拼接正确。CKLF1 可能的信号肽切割位点分析用 PcGene、Prosite 软件和 Signal P server (http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 进行分析。CKLF1 的染色体定位用 HTGS 数据库分析（http:/www.ncbi.nlm
10、.nih.gov） 。包含 CKLF1 基因的两个染色体片段的登录号为 AC010542 和AC018557。Northern Blot 分析我们对目的基因的表达情况进行了 Northern Blot 分析，细胞总 RNA 的提取用生命公司的 TRIZ0LTM试剂提取。分别取 20 g tester 或 driver RNA，在 1.5%的甲醛变性胶中电泳，通过毛细管吸引法将 RNA 转到尼龙膜上。探针的标记和杂交操作参照 DUPONT 公司 Random Primer Fluorescein Labeling kit with Antifluorescein-HRP (DuPont NEN
11、NELMGC-803)试剂盒说明书。标记探针的核苷酸均为来源于 SSH 杂交得到的全长 EST 片段（CKLF1 全长 cDNA 片段中的 53-530 位碱基） 。寡核苷酸用于扩增 CKLF1 及其变异体的全长 cDNA 片段的引物为： P1 5 GCA, AGA, AGC,GGG, AAG, CCG, A 3和 P2 5 GGA, AGA, ATA, CAG, AAA, TAT, GTT, TAA, TAC 3 ； 用于扩增 CKLF1 及其变异体的编码区 cDNA 片段以构建 pCDI-CKLF1 的引物为： P3 5 ATG, GAT, AAC, GTG, CAG, CCG, AAA,
12、 AT 3和 P4 5 TTA, CAA, AAC, TTC, TTT, TTT, TTC, ATG, C 3 ； 用于扩增不含终止密码的 CKLF1及其变异体的 cDNA 片段，以构建 pEGFP-N1-CKLF1, pEGFP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4 的下游引物为： P5 5 CGG GAT CCA AAA CTT CTT TTT TTT CAT GC 3CKLF1 表达谱分析用巢式 PCR 的方法对 CKLF1 及其变异体在各种不同组织中的表达水平进行分析，用 Clontech 公司Multiple Tissue cDNA Panels 试剂盒提供的单链 cD
13、NA 文库作模板，利用 P1，P2 和 P3，P4 引物，进行PCR 扩增。在第一轮 PCR 反应中，取 1lcDNA 文库作模板，反应体系为 25l，进行 25 个循环；在第二轮PCR 反应中，取 1l 第一轮 PCR 产物作模板，反应体系为 25l，进行 20 个循环。取 10l 第二轮 PCR 产物，在 5%SDS-PAGE 胶中电泳。质粒构建为了对 CKLF1， CKLF2 和 CKLF4 的亚细胞定位进行研究，将去终止码的相应序列克隆到表达载体pEGFP-N1 中。用 P3 和 P5 引物，从 PHA 刺激的 U937 细胞 cDNA 文库中，扩增 CKLF1，CKLF2 和 CKL
14、F4 的cDNA 序列，在 P5 引物中，终止码被去除，并引入 BamH1 酶切位点。PCR 产物用 Klenow 酶处理为平端，然后用 BamH1 酶切。pEGFP-N1 载体先用 EcoRI 酶切，再用 Klenow 酶处理为平端，然后用 BamH1 酶切。酶切处理后的载体片段和目的基因片段回收后，连接得到重组质粒 pEGFP-N1-CKLF1，pEGFP-N1-CKLF2 和pEGFP-N1-CKLF4。用 P3 和 P4 引物从 PHA 刺激的 U937 细胞 cDNA 文库中，扩增 CKLF1 的 ORF 片段，克隆入 pGEM-T 载体中，测序。用 EcoRI 将插入片段释放出来，
15、连接至经 EcoRI 切后，并用 CIP 处理后的 pcDI载体中，经酶切鉴定可得到 CKLF-1 的正义表达载体 pcDI-CKLF1。pcDI 是将 pcDNA3 的 BglI-kpnI 片段与pCI 的 BglI-KpnI 片段置换后得到的一个真核表达载体（7）。转染和转染试剂在瞬时转染中， COS-7 细胞在 10%胎牛血清的 DMEM 中培养。用 SuperFect 转染试剂，根据说明转染COS-7 细胞。48 小时后，收集转染上清，用于活性分析和 Western blot 分析。细胞用 PBS 洗，甲醛固定30 分钟，再用 PBS 洗，荧光显微镜观察。CKLF1-EGFP，CKLF
16、2-EGFP，CKLF3-EGFP 在 COS-7 细胞上清中的 Western blot 分析将 pEGFP-N1，pEGFP-N1-CKLF1, pEG FP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4 四种质粒分别转染 COS-7 细胞，48 小时后，各取 70l 细胞上清，进行 SDS-PAGE 电泳，电转至尼龙膜上，与抗 EGFP 多克隆抗体反应，再与 HRP 标记的二抗反应，用化学发光的方法进行检测。趋化实验按照以前报道的方法（8），从健康成年志愿者外周血中分离嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。纯化的嗜中性粒细胞重悬于 HBSS 缓冲液中，细胞密度为 1X106/ml；淋巴细胞和单核细胞重悬于含 0.5%低内毒素 BSA 和 20mM Hepes 的 1640 培养液中，细胞密度分别为 5X106/ml 和 2X106/ml。细胞趋化实验用 48 孔趋化小室，按照文献报道的进行（9）。小孔的下面装满 COS-7 细胞的转染上清，上面是各种不同类型的细胞。用于嗜中性细胞的聚炭膜孔径为
