基因工程知识点

《基因工程知识点》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程知识点（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、名词解释名词解释1.基因工程基因工程：是将目的基因或 DNA 片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。2.限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶：能够识别双链 DNA 分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。3.同切点酶同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同 DNA 序列的限制性内切核酸酶。4.同尾酶同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端。5.酶的星号活性酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、

2、高浓度的甘油、低离子强度、极端 pH 值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。6.DNA 连接酶连接酶：是能催化双链 DNA 片段靠在一起的 3羟基末端与 5端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。7.载体载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。8.多克隆位点多克隆位点：是包含多种同一个限制性酶切点的一段很短的 DNA 序列9. 互补互补：为质粒 DNA 编码 半乳糖苷酶的 亚基，宿主细胞可编码 亚基虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补

3、现象叫 互补。10.黏粒载体黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有 -DNAcos 序列和质粒复制子的特殊类型的载体。11.质粒：质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子12.探针：探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸分子称为探针(probe)，可以是 DNA，也可以是 RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD 序列序列：是存在于原核生物起始密码子上游 7-12 个核苷酸内的一种 4-7 个核苷酸的保守片段，它与 16SrRNA3端反向互补，所以可将 mRNA 的

4、AUG 起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。14、包含体：、包含体：目的蛋白子啊细胞质的还原性环境中，以不溶性的形式产生并聚集形成蛋白质聚合物即为包含体。简答：简答：1. 影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素答：1）DNA 的纯度2）DNA 的甲基化程度3）消化反应的缓冲液系统4）DNA 的分子结构5）酶的纯度6）酶切反应的温度7）酶的星号活性2.大肠杆菌大肠杆菌 DNA 聚合酶聚合酶与与 klenow 片段的比较片段的比较答：1）结构上的区别：Klenow 片段是完整 DNA 聚合酶的一个片段，是用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌 DNA 聚合酶时，得到的两个片

5、段中分子量较大的一个，具有 53聚合酶活性和 35的外切酶活性，不含 53外切酶活性。2）功能上的区别：DNA 聚合酶 I 可通过 DNA 缺口平移的方法制备 DNA 探针。而klenow 酶主要用于缺口平移标记 DNA，也用于 DNA 的缺口补平和延伸。还在 cDNA 克隆中用于第二条 cDNA 链的合成。3.载体的基本条件载体的基本条件答：1）.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，可以携带外源基因进入受体细胞；2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；3）.具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；4）.具有较高的外源 DNA 的载装能力；5）.具有合适的筛选标记。4.

6、质粒的基本性质质粒的基本性质答：（1）自主复制。质粒 DNA 上都含有一个复制起始区，控制着质粒在宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子”。一般一个质粒 DNA 分子上只含有一个复制子。按复制能力可将质粒分为严紧型和松弛型两类。（2）不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质粒。（3）转移性：能在自然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）的质粒称为接合型质粒；不能在自然条件下独立地发生接合作用的质粒称为非接合型质粒。（4）编码性状：野生型的质粒 DNA 上往往携带一个或多个

7、遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。5、Southern 杂交（杂交（DNA）步骤）步骤:答：DNA 的片段化及其电泳分离；凝胶电泳后的变性处理；转移并固定到滤膜上；杂交；检测与分析6、基因组文库与、基因组文库与 cDNA 文库的区别文库的区别基因组文库：基因组文库简称基因文库，是将某一生物基因组 DNA 片段化并全部克隆后获得的重组子群体的总称。CDNA 文库：是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部 mRNA 反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了全部表达基因的转录本。区别：基因组文库包含全部基因，但 cDNA 文库石油 mRNA 反转录得到的

8、， ，已经去掉基因中的内含子部分7.比较克隆载体与表达载体的异同比较克隆载体与表达载体的异同同：1）.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，可以携带外源基因进入受体细胞； 2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；3）.具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；4）.具有合适的筛选标记。异：1）表达载体在克隆载体的基础上又增加了基因表达的调控元件：即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号（区分二者的标志）2）克隆载体在菌体中一般是多拷贝的，而表达载体一般是低拷贝的。8、外源基因在大肠杆菌中的表达形式有哪些？如何纯化？、外源基因在大肠杆菌中的表达形式有哪些？如何纯化？1）包含

9、体蛋白：纯化步骤：细胞收集与破碎，洗涤与溶解，变性蛋白质的纯化，重组蛋白质的复性，天然蛋白质的分离。2）融合蛋白：融合蛋白的提取，重折叠，纯化，天然蛋白的回收以及蛋白质的水解保护。3）分泌型蛋白：首先要进行浓缩处理，然后再根据发酵液中的有效成分和杂质之间的理化性质存在的差异来考虑选择合适的纯化方法。如离子交换层析，亲和层析，凝胶过滤等。4）可溶性表达产物：经细胞破碎后的可溶性离心上清液，可利用如果有可利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基， ，可选用亲和层析分离法。对处于极端等电点的蛋白，采用离子交换层析分离。5）周质表达蛋白：大肠杆菌细胞低浓度溶菌酶处理，渗透压裂解法，周质腔分离出目的蛋白。

10、9、抑制性消减杂交（、抑制性消减杂交（SSH）的原理和过程）的原理和过程原理：SSH 的核心技术是抑制性 PCR，它是一种将检测子 cDNA 单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术。抑制性 PCR 是利用链内复性优先于链间复性的原理，是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“锅柄样”结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。论述题：论述题：1、PCR 技术的原理、成分、步骤、应用及引物设计的要求技术的原理、成分、步骤、应用及引物设计的要求1）原理: PCR 技术是以 DNA 互补链的聚合反应为基础，通过 DNA 变性、引物与模板DNA 一侧的互补序列复

11、性杂交，由 DNA 聚合酶催化引物延伸,最终获得特异 DNA 片段的体外扩增方法。2)成分：模板、引物、DNA 聚合酶（耐高温） 、Dntp3）步骤：变性：系统加热至 92-96，使 dsDNA（双链）解链成为 ssDNA（单链） ，且热变性不改变其化学性质；退火：降温至 37-72，使引物与模 板的互补区相结合； 延伸：在 72条件下，DNA 聚合酶将 dNTP 连续加到引物的 3-OH 端，合成DNA。4）应用：1、引物设计；2、限制性内切酶位点分析；3、DNA 基元查找；4、同源性分析5）引物设计：长度：至少 16bp，通常为 18-30bp：两个引物之间的 Tm 最好接近，最好 1以内

12、，最多不超过 5；避免引物内部或引物之间存在互补序列；G+C 含量应尽量控制在 40%至 60%之间；引物 3端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响，A 的错配概率较高，应尽量避免使用；引物 3端出现 3 个以上的连续碱基，如 GGG 或 CCC，也会使错误引发机率增加；最好在模板 cDNA 的保守区内设计；引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发；的 5端可以修饰，而 3端不可修饰。2.基因工程技术流程基因工程技术流程答：1）目的基因克隆2)载体的准备3）目的基因与载体的连接4）重组 DNA 转化/转染/转导5）体的筛选与鉴定

13、6）重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用3、转化率的计算（结合、转化率的计算（结合 2 回答）回答）例题：某一 DNA 重组实验的充足率为 20%，转化率为 107/mg 载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体低约 100 倍，欲获得 104 个重组克隆，需要投入多少载体DNA 进行重组实验？解答：若重组率为 100%，则转化后产生 104 个重组克隆需要 0.1mg 载体 DNA,重组率为 20%时投入载体为 0.5mg，载体投入量确定后，即可按 10:1 的要求算出 5mg。4、根据同源性设计引物（、根据同源性设计引物（p102-104）/5RACE 扩增扩增1）分

14、析核心区段获得某蛋白质的氨基酸序列，根据密码子与氨基酸对应关系，选取两段连续的保守氨基酸序列，写出其可能的编码序列，对蛋白质同源性或同源性基因 cDNA 序列进行充分的比对，如果利用的是蛋白质序列资料，在蛋白质数据库中比较与之同源的蛋白序列，找出蛋白质保守性高的区域，作为引物设计的位点，如果是利用同源 cDNA 的资料，从数据库中获得多个近缘物种同源序列后，进行序列多重比较，选择高保守性区段序列并设计引物。2）设计简并引物和扩增核心区段由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列，称为简并序列。相应合成这一段序列作 PCR 扩增体系的引物即为简并引物。在选取

15、氨基酸序列时往往优先选取对应密码子较少的残基，为了降低简并度，放弃最后一个氨基酸 其密码子的第三位碱基。设计核心区段扩增的简并引物还要考虑扩增区段的长度和在cDNA 分子中的位置，通常扩增序列在几百碱基内效果较好。3）设计 RACE 引物，并进行 3RACE 和 5RACE 扩增 3RACE 根据中间核心序列设计出 3端 RACE 的上游引物后，利用 dT 作为下游引物，利用 mRNA 反转录成的第一链 cDNA 作为模板将 cDNA3端扩增出来5 RACE 尽管其下游引物可以根据克隆的核心序列可以确定下来，但由于 5端上游序列未知，上游的引物难以确定，因而 5 RACE 要采用一些特殊方法确

16、定其上游引物位点。5.基因工程的安全性问题（主观题，可两方面分析）基因工程的安全性问题（主观题，可两方面分析）其他知识点其他知识点1、Northern 杂交（RNA）; Western 杂交（蛋白质）2、核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；所以核酸带负电荷，在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移。3、TA 克隆法（填空）A/T 克隆法是目前使用最广泛的 PCR 产物克隆法，无须在产物末端添加酶切位点；主要适用于 Taq DNA 聚合酶扩增的产物；Taq DNA 聚合酶具有末端转移酶的活性，可以在扩增的 DNA 片段 3 末端添加一个 A(腺苷酸)；Taq DNA 聚合酶扩增产物可与 T-载体进行互补连接，从而达到高效克隆的目的。4、凝胶电泳的介质：琼脂糖和聚丙烯酰胺5、切口平移制备探针（图，p75）6、基因工程的基本条件：目的基因、载体、工具酶和宿主细胞7、YAC 载体的装载量最大8、限制性内切核酸酶的命名：答：