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1、1一种磷脂酶一种磷脂酶 A2抑制剂体外高通量筛选方法的建立抑制剂体外高通量筛选方法的建立朱京童 郑智慧 路新华 范玉玲 张华 贺建功（华北制药集团新药研究开发中心，微生物药物国家工程研究中心 石家庄 050015）摘要：目的摘要：目的：磷脂酶 A2(PLA2)是一个重要的抗炎和心血管疾病药物靶点，本研究拟建立一种荧光的磷脂酶 A2 (PLA2)抑制剂体外高通量药物筛选方法。方法方法：以 7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate 为荧光底物，水解产物在 355ex/460em 下有特定荧光，间接反映酶活性。利用 96 孔板，通过对酶浓度、反应时间等多个条件的优化，摸索最佳
2、的反应条件。利用阳性药二乙烯三胺五乙酸进行模型验证。结果：结果：在酶浓度 2.25U/ml、底物浓度 30M 和反应时间 30min 时，为最适反应条件。阳性药在该模型上表现出好的浓度剂量依赖抑制效果，IC50为0.37mol/L。利用该模型，本研究从微生物次生代谢产物筛选得到两个活性化合物 F02ZA-2396A、F02ZA-2396B，其 IC50分别为 152M 和 72M。结论：结论：本研究建立了一个高通量的磷脂酶 A2抑制剂体外药物筛选方法，该方法灵敏、快捷、可操作强，可用于各种来源的化合物的快速活性筛选。关键词：关键词：磷脂酶 A2；抑制剂；体外；荧光法A fluorescence
3、-based method on the high throughput screening assay for PLA2 inhibitor in vitroZhu Jing-tong, Zheng Zhi-hui, Lu Xin-hua, Fan Yu-ling, Zhang Hua, He Jian-gong(New Drugs Research inhibitor; in vitro; fluorescence作者简介：朱京童， （1977 年出生） ，女，硕士在读，工程师。研究方向：药物筛选基金资助：国家科技部创新药物筛选技术平台研究资助项目，项目编号：2002AA2AZ343D通信
4、地址：E-mail:磷脂酶A2(phospholipase A2 PLA2)是一种重要的代谢和调节酶类，已有150个以上的氨基酸序列可在蛋白质序列库中找到1。在生物界中分布广泛，大量存在于蛇毒、蜂毒、蝎毒，动物胰脏及植物组织中2。所有的PLA2都有一种最基本的作用，就是水解磷脂sn-2位脂肪酸，释放自由脂肪酸和溶血磷脂，直接或间接作用于靶细胞，广泛参与人体生理性细胞内外信号的传递及炎症、多种炎症相关疾病等多种病理过程。是花生四烯酸、溶血磷脂等炎性介质生成的限速酶，促进了一系列炎性介质和细胞因子的大量释放和激活，是前列腺素和血小板活化因子生成的关键酶，在炎性病变的发生和发展过程中起重要的作用，直
5、接影响其发展和预后3。因此磷脂酶A2抑制剂近年来越来越引起了人们的极大关注。为了寻找新的 PLA2抑制剂，本研究利用荧光方法建立了一种高通量的PLA2抑制剂体外筛选模型，该模型的建立为从微生物的次生代谢库、合成化合物库以及植物来源的化合物中发现新的 PLA2抑制剂，研究开发新的 PLA2抑制剂药物研发奠定基础。1 材料与方法材料与方法1.11.1 筛选用微生物菌株筛选用微生物菌株放线菌和真菌由本室微生物菌种库提供，微生物的代谢产物经溶媒提取，DMSO 溶解作为筛选样品。1.21.2 试剂及仪器试剂及仪器 磷脂酶 A2（PLA2）购自 Sigma 公司,荧光多肽底物 7-Hydroxycouma
6、rinyl-arachidonate 购自 BIO-MOL 公司；二乙烯三胺五乙酸3（Diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA）购自 Sigma 公司；Victor1420多标计数仪（美国 PE 公司）1.31.3 PLA2PLA2 活性测定原理及方法活性测定原理及方法测活原理与方法参考文献4,5，并稍加改动。缓冲液配方：50mM Tris-HCL ,25mM CaCL2（PH 8.0） 。缓冲液预先保存于 4C。以荧光标记的多肽 7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate 为底物，利用水解后的产物在 355ex/460em 的荧光读
7、值，通过测定酶反应前后荧光 F 值的变化，确定 PLA2酶的活性。反应式如下： PLA27-Hydroxycoumarinyl-arachidonate 7-Hydroxycoumarinyl + arachidonate（355ex/460em）筛选的操作过程为6：在 96 孔板中加入测试样品（DMSO 溶解）2l/孔， 用等体积 DMSO 作为对照，加 PLA2酶液 35l/孔。使用 1420 Victor2多标计数 仪在 355/460nm 波长下，读取每孔 F1值（样品本底 F1） ；加入底物 15l， 37保温反应 30 分钟后再次读取每孔的 F2值，并计算抑制率，1.41.4 真菌
8、真菌 F02ZA2396AF02ZA2396A、F02ZA2396BF02ZA2396B 的培养的培养将菌株斜面接种于种子培养基（淀粉 2%，葡萄糖 1%，黄豆饼粉 0.2%，麦芽粉 0.6%, 酵母 0.5%, CaCO3 0.2%，MgSO47H2ONaCl 0.2%，pH 7.0） ，27 摇瓶培养 3 天。按 1%接种的量接种发酵培养基 (淀粉 1.0%，葡萄糖 2%，黄豆饼粉 1.3%，酵母粉 0.4%，麦芽粉 0.8%，NaCl 0.05%, CaCO3 0.15%, pH 7.0) 27振摇培养 6 天。1.5 模型的验证：模型的验证：Z因子是评估测试方法质量的主要参数7。Z=1
9、-3x(SDs+SDb)/MS-MB，(SD=标准差, s=信号, b=背景)。范围可以从 1 到小于 0。在测试方法的建立确证和高通量筛选的过程中，Z因子应大于 0.4。2.2.实验结果实验结果样品抑制率(I%) 100%F2 - F1 (对照) F2 - F1 (样品)F2 - F1 (对照) F2 - F1 (空白)42.1 不同酶浓度与水解产物生成量（不同酶浓度与水解产物生成量（F 值）的关系值）的关系 为了确定最佳的酶反应浓度，固定底物浓度 30M 和反应时间 30min，将酶液进行稀释。酶起始终浓度 72 U/ml，后二倍梯度稀释 12 个浓度组（至 0.03 U/ml）进行活性测
10、定。结果（图 1）显示，酶浓度在 0.282.25U/ml 间与 F 值呈良好线性关系。当酶浓度大于 2.25U/ml，F 值转向平衡。该模型的酶量从线性范围较好的酶浓度确定，本研究选择酶浓度为 2.25 U/ml。02000400060008000100000.280.561.1252.254.59酶单位（unit/ml）F 355/460nm图 1 不同酶浓度与 F 值变化的关系2.22.2 反应时间与水解产物生成量（反应时间与水解产物生成量（F 值）的关系值）的关系 为了确定最佳的反应时间，利用 96 孔板，在底物终浓度为 30M、酶浓度 2.25 U/ml 的条件下，测定不同反应时间（
11、0min180min，每隔 5min 测定一次）与 F 值的关系。图 2 显示在反应时间为 35 分钟范围内与 F 值之间均呈很好的线性关系。反应 35 分钟后，F 值渐趋向平衡。根据结果，选择线性范围内反应时间（0 35min） ，所以将模型筛选时反应时间控制为 30 分钟左右。020004000600080001000012000051015202530354045反应时间（min）F 355/460nm图 2 不同反应时间与 F 值变化的关系52.32.3阳性对照二乙烯三胺五乙酸对阳性对照二乙烯三胺五乙酸对 PLA2的抑制活性的抑制活性 为了验证所建立模型的灵敏度和稳定性，本研究利用已报
12、道的 PLA2的抑制剂二乙烯三胺五乙酸（图 3）作为阳性药物。固定底物浓度 30M、酶浓度2.25U/ml 和反应时间 30min，二乙烯三胺五乙酸起始终浓度为 100mol/L ，后二倍梯度稀释 18 个浓度组进行抑制活性测定。结果（图 4）表明二乙烯三胺五乙酸在该模型上表现出强的抑制活性，在 0.00625mol/L 间并具有较好的量效关系，其 IC50为 0.37mol/L。筛选模型的 Z因子0.87 ,信噪比（S/B）5。图 3二乙烯三胺五乙酸的化学结构0204060801000.0060.0240.0980.3901.5606.25025.000抑制剂浓度（mol/l）抑制率（%）图
13、 4 二乙烯三胺五乙酸对 PLA2的抑制曲线2.42.4 F02ZA2396A 、F02ZA2396B 对对 PLA2 活性抑制作用活性抑制作用 在酶浓度2.25U/ml，底物浓度 30M 下，37C 反应 25 分钟，对 F02ZA2396A（图 5） 、F02ZA2396B（图 5）进行活性测定。样品起始终浓度为 80g/ml，后三倍梯度稀释 8 个浓度组，根据结果计算两个化合物的 IC50值分别为 152M、72M。6HOOHOOHOHOOC20H22O7 Mol. Wt.: 374.38HOOHOOHOOOOHOHOMol. Form. C30H32O10 Mol. Wt.: 552.
14、57F02ZA2396A F02ZA2396B图 5 F02ZA2396A、F02ZA2396B 的化学结构3 讨论：讨论：磷脂酶 A2由于参与体内免疫、信号传递和炎症反应等多种生物作用而受到越来越多的重视。从当前的研究结果看，磷脂酶 A2 在抗菌、抗炎症方面，甚至在治疗某些心血管疾病及神经系统疾病中有着广泛的应用前景。动脉粥样硬化是心血管疾病的病理生理基础，是西方发达国家的主要死亡原因。随着我国人民生活水平提高和饮食习惯改变，也成为我国主要死亡原因。防治动脉粥样硬化是目前医学领域急需解决的一个重要课题。当前对动脉粥样硬化的治疗仍以降脂药物为主。PLA2 作为一个非降脂药物发现的新靶点,其抑制
15、剂对动脉粥样硬化疾病的预防和治疗具有着广阔的应用前景。PLA2活性测定方法很多，包括滴定法8、指示剂比色法9、荧光标记法10，11、放射标记法12，13等。但上面些方法因其操作繁琐、灵敏度差、体外反应体系所需液体量大、需特殊标记物或专用仪器等原因，并不适于PLA2抑制剂的高通量筛选。我们以 PLA2催化水解 7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate 为基础，测定在355ex/460em 波长下的荧光读值，间接反应酶的活性。采用荧光法建立了一个高通量 PLA2抑制剂体外药物筛选模型，并对酶浓度、反应时间与水解产物的生成量的关系进行了考察，表明两者与 F 值均呈良好的线性关系。本研究用二乙烯三胺五乙酸作为阳性对照，在本模型上显示较好的量效依赖关系，IC50值低于已报导的抑制剂，说明了该筛选模型的灵敏度。Z因子（0.87）以及高信噪比（S/B5）说明该模型具有较高稳定性。可高通量应用于筛选。7参考文献参考文献1 Heller A, Koch T, Schmeck J,et al. Lipid mediators in inflammatory disordersJ.Drugs,1998,55(5):487-496.2 王兴勇，李晓文，卢仲毅，等。磷脂酶 A 2 激活在鼠急性食品与药品 2007，9（7）543 Vadas P,Pruza
