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1、观察肺炎链球菌性肺炎的病因观察肺炎链球菌性肺炎的病因-肺炎链球菌肺炎链球菌研究目的：用透射电镜观察肺炎链球菌的超微结构肺炎链球菌简称肺炎球菌。1881 年首次由巴斯德及 G. M. Sternberg 分别在法国及美 国从患者痰液中分离出。为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌， 有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。5%10%正常人上呼吸道中携带此菌。有毒株是 引起人类疾病的重要病原菌。透射电镜的工作原理透射电镜的工作原理透射电镜的成象原理是由照明部分提供的有一定孔径角和强度的电子束平行地投影到处 于物镜物平面处的样品上，通过样品和物镜的电子束在物镜后焦面上形成衍射振幅极大值
2、， 即第一幅衍射谱。这些衍射束在物镜的象平面上相互干涉形成第一幅反映试样为微区特征 的电子图象。通过聚焦（调节物镜激磁电流） ，使物镜的象平面与中间镜的物平面相一致， 中间镜的象平面与投影镜的物平面相一致，投影镜的象平面与荧光屏相一致，这样在荧光 屏上就察观到一幅经物镜、中间镜和投影镜放大后有一定衬度和放大倍数的电子图象。由 于试样各微区的厚度、原子序数、晶体结构或晶体取向不同，通过试样和物镜的电子束强 度产生差异，因而在荧光屏上显现出由暗亮差别所反映出的试样微区特征的显微电子图象。 电子图象的放大倍数为物镜、中间镜和投影镜的放大倍数之乘积，即 MM。MrMp.磷钨酸悬滴法负染色技术磷钨酸悬滴
3、法负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。负染色首先由 Hall 在 1955 年提出。Hall 在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮 晶的“空洞“被清楚地显示出来。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被 加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色 则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)“包埋“低电子密度的样品，结果 在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明“地光亮。两者之间的反差正好相反，故称为负染 色。染色液的制备染色液的制备磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液
4、配制成 13的溶液，使 用时应用 1 molL 氢氧化钠溶液将负染色液的 pH 值调至 6.47.0 或实验所需的值。染色方法染色方法悬滴法 用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到 管上来或翻转而被污染。如果用 Formvar 膜时，在制好膜后，可以直接在粘于滤纸上的铜 网进行负染色操作。如果用碳膜时，要用镊子夹着铜网，滴液后静置数分钟，然后用滤纸 从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色 12 分钟用滤纸吸去负染色液，再用 蒸馏水滴在铜网上洗 12 次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。干燥时，由于表 面张力的作用，某些敏感的材料可能受到损伤，可用戊二
5、醛或四氧化锇预固定。预固定在 滴样之后进行。肺炎链球菌的超微结构肺炎链球菌的超微结构染色革兰染色阳性，菌体呈矛头或瓜籽仁状，直径约 1um，常以钝端相对、尖端向外成 双排列，无鞭毛，无芽孢 。在机体内或含血清的培养基上有较厚的荚膜，人工培养后荚膜 逐渐消失。革兰染色时荚膜不着色，表现为菌体周围透明环。菌体衰老时，或由于自溶酶 的产生将细菌裂解后，可呈革兰染色阴性。 需氧或兼性厌氧。营养要求较高，最适温度为 37，最适 pH7.47.8，在血液或血清 的培养基中才能生长，形成细小圆形、隆起、表面光滑、灰白色、湿润并有草绿色溶血环 的菌落，与甲型溶血性链球菌很相似 。抗原构造与分型抗原构造与分型1
6、、荚膜多糖抗原：存在于肺炎链球菌荚膜中。根据荚膜多糖抗原性的不同，可将肺炎链球 菌分为 84 个血清型，分别以 1、2、3、4 等表示之，个别型还可分成不同的亚型，如 7A、7B、7C 和 7D 亚型。其中有 20 多个型别可引起疾病，以 1-3 型致病力较强2、菌体抗原（1）多糖：存在于肺炎链球菌细胞壁中，为各型菌株所共有，具有种特异性。C 多糖可被血清中 C-反应蛋白沉淀。在 Ca2+存在时，C 多糖可与血清中一种称为 C 反应蛋白（CRP）结合，激活补体，促进吞噬细胞的吞噬功能。正常人血清中 CRP 含量极微。当急性炎症时含量剧增，故用 C 多糖来检测 CRP 对活动性风湿病及急性炎症性疾病的诊断有一定意义。（2）M 蛋白：具有型特异性，类似 A 群链球菌的 M 蛋白，但与菌的毒力无关致病物质致病物质1、荚膜：是肺炎链球菌主要的致病因素。有荚膜的肺炎球菌可抵抗吞噬细胞的吞噬，有利于细菌在宿主体内定居并繁殖。2、肺炎链球菌溶血素：高浓度时对实验动物有致死性。对人的致病机制尚待确定。3、紫癜形成因子：注入家兔皮内，可产生紫癜及出血点并伴有 内脏出血。紫癜形成因子与人类肺炎球菌感染间的关系尚不明确。4、神经氨酸酶：在新分离株中发现，能分解细胞膜糖蛋白和糖脂的 N-乙酰神经氨酸，与肺炎链球菌在鼻咽部和支气管黏膜上定植、繁殖和扩散有关。
