建立pcr实验室的基本条件

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1、建立建立 PCR 实验室的基本条件实验室的基本条件临床基因扩增实验室采用 PCR 技术用于临床基因诊断，由于 PCR 技术对所检测的核 酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致临床检测标本假阳性结果；另外由于 PCR 技术要求高、影响因素多（特别是 RNA 标本） ，实验过程处理不当易导致核酸模板无扩增 现象，导致临床标本假阴性结果。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是 PCR 技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。 二、PCR 实验室验收准备工作 （一）（一）硬件准备硬件准备实验室基本建设实验室基本建设 1.根据文件要求，临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区

2、域：试剂贮存 和准备区；标本制备区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区，如使用全 自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。 2.各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。 3.进入各工作区域必须严格按照单一流向进行，即试剂贮存和准备区标本制备区扩 增反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区。 4.不同的工作区域使用不同的工作服（不同的颜色） 。工作人员离开各工作区域时，不得 将工作服带出。 5.工作区域仪器设备配置标准试剂贮存和准备区 28和-15冰箱：混匀器；微量加样器（覆盖 11000l） ；移动紫外灯（近工作台面） ；消耗品：一次性手套、一次性吸 水纸、耐高压处理的

3、离心管和加样器吸头（带滤心） ；专用工作服和工作鞋； 专用办公用品等。 标本制备区 28冰箱，-20或-80冰箱；高速台式冷冻离心机；混匀器； 水浴箱或加热模块；微量加样器（覆盖 11000l） ；可移动紫外灯（近工作 台面） ；超净工作台，消耗品；一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离 心管和加样器吸头（带滤心） ；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。 扩增反应混合物配制和扩增区核酸扩增仪；微量加样器（覆盖 11000l） ； 可移动紫外灯（近工作台面） ；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压 处理的离心管和加样器吸头（带滤心） ；专用工作服和工作鞋；专用办公用品 等。 扩增产物分析区

4、视检测方法不同而定。基本仪器设备如下：微量加样器（覆 盖 1200l） ；可移动紫外灯（近工作台面） ；消耗品：一次性手套、一次性 吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） ；专用工作服和工作鞋； 专用办公用品等。（二）软件建设（二）软件建设质量手册编写与实施、人才资源（上岗证培训质量手册编写与实施、人才资源（上岗证培训与相关知识学习）与相关知识学习） 1.临床基因扩增检验实验室的质量手册编写质量手册是阐明临床基因扩增检验实验室 的质量方针，并描述过其质量体系的文件。质量手册规定了质量体系的基本结构，是实施 和保持质量体系应长期遵循的文件。临床基因扩增检验实验室质量手册编写应依照卫生部

5、 下发两个文件，并结合本实验室实际情况编写适合本实验室的切实可行的质量手册。质量手册的提纲应包括三部分：质量方针和宗旨；工作制度；标准操作文件（SOP）（1）质量方针和宗旨制定临床基因扩增检验实验室的质量管理目标和质量保证体系的 结构体系和总方针。（2）工作制度一般应包括以下文件：实验室的设置、布局及组织结构；实验室内务管 理制度；实验室的人员配置及管理制度；生物的防护与安全制度；实验室废弃物处理制度； 实验室清洁消毒制度；仪器设备的管理制度；仪器、试剂、耗材购置程序及管理制度；临 床标本的管理制度；实验室记录的管理制度；质量控制工作管理制度；结果报告管理制度； 抱怨的内部处理制度；负责人及质

6、检员职责；岗位设置和责任制等 （3）标准操作程序（SOP）一般包括：消毒液配制标准操作程序：消毒标准操作程序； 超净工作台使用标准操作程序；超净工作台维护和保养标准操作文件；PCR 仪使用标准操 作程序；PCR 仪维护和保养标准操作程序；高速低温离心机使用标准操作程序；移液器使 用标准操作程序；冰箱维护和保养标准操作程序；电热恒温水浴箱操作程序；电子天平使 用和校正操作程序；可移动紫外消毒车使用操作程序；加样器校准标准操作程序；离心机 维护保养操作程序；温度计校准程序；试剂的质检操作程序；标本唯一标识编号编制规则； 临床标本的采集及处理操作程序；临床标本的保存程序；乙肝病毒核酸扩增荧光检测标准

7、 操作程序；丙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序；结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测标 准操作程序；沙眼衣原体核酸扩增荧光检测标准操作程序等 （4）引用图表：PCR 扩增可接受标本记录表；PCR 扩增拒收标本记录表；室内质控 结果记录表；室间质控记录表；消耗性材料验收记录表；试剂验收记录表；故障处理表； 台阶式高速离心机使用记录表；台式高速冷冻离心机使用记录表；扩增仪维护保养记录表； 人员培训计划及培训记录表；实验室工作人员一览表；主要设备一览表；实验室清洁消毒 记录表；工作区温度、湿度记录表；抱怨记录表；标本超低温保存记录表；应急处理记录 表；垃圾处理记录表；冰箱温度记录表；水浴箱温度记录表；移动

8、紫外消毒车记录表；设 备校正记录表；检测结果报告流程；报告单样张；临床送检标本流程图；实验室组织结构 图。为了对以个特定序列进行 PCR 做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技 术操作和试剂在下面详细列出. 1、样品准备区这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措 施： 1）PCR 产物和带有要扩增序列的 DNA 克隆不能在这个房间操作。 2）组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理，以根据应用的需要提取 DNA 或 RNA。 3）用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。 4）DNA 样品应该用有专门的防护或正

9、压活塞式移液管操作，以防止在吸取样品时有 气溶胶遗留。 5）大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。 6）管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，这样会产 生气溶胶。 7）任何时候都应该穿实验服和带手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步之 间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。2、样品准备和 RNA-PCR RNA-PCR 的额外步骤需要额外的样品操作，这样增加了样品之间污染的机会。为了 避免这一问题，反转录一步可以在样品准备区进行。在 RNA-PCR 中应用 UNG 以防止污染 的方法也有报道。3、前 PCR 区必须有专门用于准备各种反应的区

10、域，这个区域必须保持干净，而且没有来自克隆和 样品准备的污染。前 PCR 区必须要有试剂和准备，特别是专门用于前 PCR 区的正压活塞 式移液管。4、PCR 实验室试剂的操作1）所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase 和 RNase）污染。 2）所有 PCR 试剂中使用的水都应该是高质量的新鲜蒸馏的去离子水，用 0.22m 过滤的，并且是高压灭菌。 3）在 20到 25贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样 品制备试剂中加入 0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。 4）所用试剂都应该以大体积配制，实验一下看试剂是否满意，然后分装成仅够一次使 用的量进行贮存。

11、5）所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。 6）新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。 7）样品准备和前 PCR 区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。5、在前 PCR 区建立 PCR 混合物1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20或 4，在实验室 只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。 2）如果你的实验室使用多套引物，以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经 济，可以考虑分装保存够一天的 PCR 成分。 3）作为一个规则，应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和 PCR 前过程的效率和洁净程度。而且，你也希望

12、通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你 的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。 4）阴性样品要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存 在 PCR 产物的污染，阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。 5）当做阳性对照时，有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。 6）由于必须有对照反应，对照模板的特点应该予以考虑。6、控制污染的方法已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染使用 UNG，这一技术能有效地消除由 PCR 产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线，这种方法不能完全消 除污染问题，但可以将污染降低几个数量级。7、PCR 仪的位置8、后 PCR 区PCR 完

13、成以后，需要分析样品并解释数据，应该留出一个专门用于反应后处理样品的 地方。后 PCR 活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的，决 不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前 PCR 活动。荧光定量荧光定量 PCR 实验室所需仪器设备清单实验室所需仪器设备清单 （卫生部推荐）（卫生部推荐）序号 仪器设备、辅助材料名称 放置地点 1 冰箱 试剂准备区 2 紫外线消毒灯 试剂准备区 3 混匀器 试剂准备区 4 可调式移液器（1-10l） ，(5-40ul)，(20-200ul)一套三把 试剂准备区 5 高速台式离心机 试剂准备区 6 专用工作服和衣柜 试剂准备区 7 冰箱

14、样品准备区 8 紫外线消毒灯 样品准备区 9 生物安全柜 B2 级 样品准备区 10 冷冻高速离心机（丙肝专用） 样品准备区 11 恒温金属浴 样品准备区 12 混匀器 样品准备区 13 可调式移液器(5-40ul)， (20-200ul) ，(200-1000ul)一套 样品准备区 14 专用工作服和衣柜 样品准备区 15 紫外线消毒灯 PCR 扩增区和产物分析区 16 可调式移液器（1-10l） ，(5-40ul)， (20-200ul)一套 PCR 扩增区和产物分析区 17 专用工作服和衣柜 PCR 扩增区和产物分析区 18 荧光定量 PCR 检测仪 PCR 扩增区和产物分析区 所有四区

15、均需准备的仪器设备为：所有四区均需准备的仪器设备为： 专用工作服和工作鞋 专用办公用品 一次性手套、一次性吸水纸 可移动紫外灯（近工作台面） 微量加样器一套（覆盖 11000ul） 以上物品各一套。 试剂贮存和准备区试剂贮存和准备区28和-15冰箱混匀器（可加热） 耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 天平 高压锅 标本制备区标本制备区28冰箱和-20或-80冰箱 高速台式冷冻离心机 混匀器 水浴箱或 PCR 仪 耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 生物安全柜 B2 级 超净工作台 超声波水浴仪（处理大分子 DNA 用） 三、扩增反应混合物配制和扩增区三、扩增反应混合物配制和扩增区 核酸扩增仪 耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 国产离心机 四、扩增产物分析区四、扩增产物分析区酶标仪、洗板机、恒温箱（PCRELISA） 加样器吸头（带滤心） 电泳仪及电泳槽 杂交仪 核酸转移仪 国产离心机