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1、中药黄芪具有显著的益气强心作用。在临床上除了用于治疗冠心病心绞痛外,还能够治疗高 血压、低血压、病毒性心肌炎、肾炎、脑梗死、心律失常等1 。现代药理研究分析，黄 芪的化学成分主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类以及氨基酸类等。黄酮的不同化学成分， 具有不同的药理活性。黄芪总黄酮(total flavonoids of astragalus, TFA)是从豆科类植物黄芪 中分离出来的有效活性成分，实验表明它具有清除多种自由基的功效，并且对自由基所致 细胞膜蛋白质以及 DNA 损伤有保护作用2 。ATP 敏感的钾电流（ATP sensitive potassium current，IKATP）广泛分布于
2、心肌,在心肌 内层细胞呈高密度分布。IKATP 具有内向整流特性,电导性强,其活性受细胞内外不同因素 调节。确定 IKATP 的标准为:钾通道的活化不依赖于膜电位的改变,却可被胞内 ATP 所抑制;可 被二磷核苷酸(NDPs)、K 通道开放剂所激活,而被格列本脲等特异性抑制剂所抑制。心肌细 胞对缺血缺氧呈现多种反应,其中包括 IKATP 开放,这是机体防御心肌缺血损害的重要机制 之一3 。文献报道，黄芪具有明显抗心肌缺血的作用，但机制不明45 。本研究旨在 用全细胞膜片钳技术观察 TFA 对豚鼠心室肌细胞 IKATP 影响,以全面了解 TFA 抗心肌缺血 作用机制。1 材料和方法1.1 实验材
3、料TFA 由内蒙古民族大学有机化学实验室提供，豚鼠（雌雄不拘重 300350 g）由内蒙 古民族大学基础医学院动物中心提供。1.2 溶液配制(1)有钙台氏液（mmol/L）：NaCl 143，KCl 5.4，CaCl22H2O 1.8，MgCl26H2O 0.5，NaH2PO42H2O 0.25，HEPES 5；用 NaOH 将 pH 调至 7.4。无钙台氏液（mmol/L）： NaCl 143，KCl 5.4，MgCl26H2O 0.5，NaH2PO42H2O 0.25，HEPES 5；用 NaOH 将 pH 调至 7.4。 贮存液（mmol/L）：KOH 70，Lglutamic 50，K
4、Cl 40，Taurine 20，KH2PO4 20，MgCl26H2O 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 1.5，用 KOH 将 pH 调至 7.4。酶溶 液：无钙台氏液+0.4 mg/ml collagenase+0.1 mg/ml protease。(2)记录 ATP 敏感的钾通道 IKATP 电极内液(mmol/L) : KCl 140, MgCl2 1,CaCl2 22, CdCl2 0.3, TTX 0.001, HEPES 10,pH 7.3。细胞外液：KCl 120, KOH 20, EGTA 5, MgCl2 1, TTX 0.001, HEPES 10。
5、(3)TFA 按 20 mg/kg 体重加蒸馏水制备成溶液备用。1.3 豚鼠心室肌细胞急性分离方法急性处死豚鼠后，迅速开胸取出心脏，置于冰冷有钙台氏液中。行主动脉插管后固定 于 Langendorff 灌流架上逆向灌流心脏，依次使用有钙台氏液 1.5 min，无钙台氏液 6 min，酶溶液 13 min，贮存液 3 min。灌流完毕后，沿房室沟处剪下心室部分，用眼科剪将 心室肌剪成小碎块，置于盛有贮存液的三角烧杯中，于 37 的水浴箱中轻轻振荡 10 min，吸取上清液置于离心管中，离心 5 min 后弃上清液，加入贮存液，于 4 的冰箱中保 存备用。1.4 实验分组及数据的采集和处理随机选取
6、心室肌细胞分为正常对照组、TFA 20 A.对照组; B. TFA 组图 1 TFA 对豚鼠心室肌细胞 IKATP 的影响 mg/kg 体重组。在实验中，应用 Pclamp 6.0程序中的 Clampex 程序记录出原始的心室肌细胞全细胞膜电流图形，再应用 Pclamp 9.0 程序中的 Clampfit 程序对心室肌细胞 IKATP 的全细胞膜电流做统计分析。1.5 统计学处理计量资料用均数标准差（s） ，用 SPSS 11.0 统计软件进行数据统计，各组之间的 数值比较采用样本均数 t 检验进行统计学分析。P0.05 认为差异有统计学意义。2 结果TFA 对豚鼠心室肌细胞 IKATP 的作
7、用，采用全细胞膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞 IKATP，将保持电位控制在-40 mV 使 Na+通道失活，电极内液中加入的 CdCl2 具有阻断钙 电流的作用，测试电位从-100 mV 到+100 mV，阶跃命令为 10 mV，时程 300 ms，在无缺 血、缺氧及代谢受抑制的情况下，一般记录不到 IKATP 通道的开放，这与文献报道相符。 观察封接成功的正常豚鼠心室肌细胞，未发现具有 IKATP 通道特征的电流活动。而在模拟 缺血液灌流 30 min 后，可引出一外向电流,其原始电流曲线，此电流能部分地被 Glinbenclamide 所抑制，证实为 IKATP 通道电流。将每一脉冲末期记录
8、到的电流对应电压 做图，得到电流电压关系（IV）曲线，IV 曲线与 X 轴相交的电压值即为翻转电位， 加入 TFA 后与对照组比较, IKATP 峰值从（0.630.38） nA 增加到(1.120.53) nA，差异 有统计学意义 (P0.01，n=6) 。见图 1、2。图 2 TFA 对豚鼠心室肌细胞 IKATP IV 曲线的影响 3 讨论心肌细胞对缺血缺氧呈现多种反应,其中包括 IKATP 开放,这是机体防御心肌缺血损害 的重要机制之一。IKATP 参与机体心肌缺血预适应反应(myocardial ischemic preconditioning)， 心肌缺血预适应能减轻心肌缺血的继发性
9、损害。文献报道，促进 IKATP 开放的药物可减轻 心肌细胞缺血的继发性损伤，而阻断 IKATP 的药物，如格列本脲则能加剧心肌缺血,增加 梗死面积6 。人体心肌的缺血预适应机制也可能通过开放 IKATP 得到调节7 。IKATP 通道开放剂的心脏保护作用,有利于心肌细胞度过代谢危急状态。IKATP 同时增加心肌氧供,减 少氧耗,改善心脏功能。心肌缺血时,缺血区供氧与耗氧严重失衡,继而导致 IKATP 激活,引起 冠脉及其侧支血管扩张,以增加缺血区血液供应。IKATP 开放产生负性肌力作用,缺血心肌 收缩性能迅速降低,心肌耗氧量下降,从而保护心肌免遭更严重的缺血性损伤。格列本脲阻断 IKATP
10、 而增加心肌顿抑的危险, 促进 IKATP 开放的药物能减少心肌顿抑的危险,呈现改善 顿抑心脏局部心肌收缩功能和改善心肌局部血流动力学的作用8 。本研究观察到 TFA 可显著增加豚鼠心室肌细胞 IKATP。这一实验结果可以很明确解 释黄芪抗心肌缺血作用机制，黄芪是通过以下几个途径实现抗心肌缺血作用的：（1）TFA 通过促进 IKATP 开放来减轻心肌缺血的继发性损害，缩小心肌梗死面积。 （2）TFA 通过 促进 IKATP 开放引起冠脉及其侧支血管扩张,以增加缺血区血液供应。 （3）IKATP 开放产生负性肌力作用,缺血心肌收缩性能迅速降低,心肌耗氧量下降,从而保护心肌免遭更严重的 缺血性损伤
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