《抗氧化活性测定方法》由会员分享,可在线阅读,更多相关《抗氧化活性测定方法(21页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、总黄酮测定方法总黄酮测定方法仪器与设备:仪器与设备:1.恒温混匀仪 BG-200 (杭州朗基科学仪器有限公司) 2.移液枪 (p1000, p200)3.分析天平(SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220 日本岛津)4.15150 mm 玻璃试管5.具塞玻璃试管, 10 mL6.容量瓶, 1000, 100, 10 mL7. 紫外-可见分光光度计 (UV-1800 日本岛津)试剂:试剂:1.硼氢化钠 (成都市科隆化工试剂厂, NaBH4, FW 37.83, 粉末, 分析纯, 97.0%) 避光干燥保存。 2.三氯化铝 (天津博迪化工股份有
2、限公司,AlCl36H2O, FW 165,分析纯,晶体, 99.0%)3.四氯苯醌 (FW245.88,Aladdin Industrial Corporation 中国上海,FW245.88 98%,分析纯)4.乙醇(EtOH) (成都市科隆化工试剂厂,FW46.07,无水乙醇, 99.7%,分析纯)5.四氢呋喃 (THF) (广东广华科技股份有限公司,FW 72.11,99.0%,分析纯)6.冰乙酸 (成都市科隆化工试剂厂, FW60.05, 99.8%,分析纯)7.盐酸 (成都市科隆化工试剂厂,36.0%-37% w/v, 12 M,分析纯)8.槲皮素 (国药集团化学试剂有限公司,FW
3、302.24, 98%, 生化试剂 BR)9.香兰素 (天津博迪化工股份有限公司, FW152.15, 99.0%,分析纯)试剂配制:试剂配制:1.0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 mM 槲皮素溶液,溶剂为四氢呋喃:乙醇(THF:EtOH)=1:1。配制 10 mM 槲皮素标准溶液:准确称取 151.12 mg 槲皮素,用上述溶剂定溶至 50mL 容量瓶。2. 50.0 mM NaBH4 乙醇溶液: 称取 189.2 mg NaBH4, 无水乙醇溶解,定容 100mL 容量瓶。(不宜长期保存; 松开盖子以防炸裂)3.74.6 mM AlC
4、l3 6H2O 乙醇溶液 (含有 1% H2O) 称取 1.80 g AlCl3 6H2O, 1 mL 水溶解,加入适量无水乙醇,后定容 100mL容量瓶(储存防潮)。4.20.0 mM 四氯苯醌四氢呋喃溶液称取 491.8 mg 四氯苯醌, 四氢呋喃(THF)溶解定容 100mL.5.0.8 M 冰乙酸溶液 称取 4.84g 冰乙酸, 蒸馏水定容 100mL.6.16% (w/v, 1052 mM) 香兰素甲醇溶液称取 16.0 g 香兰素, 甲醇定容 100 mL.操作步骤:操作步骤:1. 用移液管准确移取 0.3、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0mL 配置
5、好的 10Mm 槲皮素标液于 10mL 容量瓶,用 THF/EtOH (1:1, v/v) 溶液定容。用移液枪移取槲皮素各浓度梯度标液 1mL 或者花椒叶各相浸膏稀释样液(5mg/mL)1mL 于玻璃试管中(样液必须现配先用) ,空白采用 THF/EtOH (1:1, v/v) 溶液 1mL。2.含有 1mL 样液或者 1 mL 槲皮素标液的试管中, 加 0.5 mL 50.0 mM NaBH4 溶液,0.5 mL 74.6 mM AlCl3 溶液,后在室温室温下于红外转子摇床内摇 30 min. 再加 0.5 mL 50.0 mM NaBH4 溶液,摇 30min。3.加 2.0 mL 冰的
6、 (4 C) 0.8 M 冰乙酸溶。避光,试管内溶液晃匀后,摇晃 15min。4.加入 1 mL 20.0 mM 四氯乙醌,后于红外转子摇床内,95 C 反应60min。5.反应完全后,自来水冷却。6.甲醇转出,至少两次,定容具塞试管于 4mL 刻度线处。7.加入 1 mL 16% 香兰素甲醇溶液, 2 mL 12 M HCl 浓盐酸,混匀后室温 (20-25 C)下避光保存 15 min。8.于 490nm 下测定吸光度值,每个样液重复三次。9.数据处理。总黄酮含量表示为: mmol 槲皮素/g 样品或者浸膏。数据为三组重复的mean SD 。数据处理:数据处理:1. 标准曲线:黄酮测定标曲
7、制作原始数据:槲皮素标准液浓度 mMAbs1Abs200.1670.169 0.30.2570.252 0.50.320.292 10.3910.388 20.5520.555 40.880.892 51.0041.122 61.2681.266 81.61.597 101.9561.959黄酮测定标曲制作原始数据的系统性描述95% 置信区间槲皮素浓度 mMMeanStd. DeviationStd. ErrorLower BoundUpper BoundMinimumMaximum00.168 0.0020 0.0012 0.163 0.173 0.1660.17 0.30.255 0.00
8、35 0.0025 0.223 0.286 0.2520.257 0.50.306 0.0198 0.0140 0.128 0.484 0.2920.32 10.390 0.0021 0.0015 0.370 0.409 0.3880.391 20.554 0.0021 0.0015 0.534 0.573 0.5520.555 40.886 0.0085 0.0060 0.810 0.962 0.880.892 51.063 0.0834 0.0590 0.313 1.813 1.0041.122 61.267 0.0014 0.0010 1.254 1.280 1.2661.268 81.
9、599 0.0021 0.0015 1.579 1.618 1.5971.6 101.958 0.0021 0.0015 1.938 1.977 1.9561.959回归方程及标准曲线:用表格内红色数据绘制,绘制时需减去空白溶液的吸光度值,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。y = 0.1743x + 0.0387; R2 = 0.9996,X:浓度 mM2. 计算公式:大红袍花椒叶不同极性溶液萃取浸膏黄酮含量测定原始数据:ABCDEF标液校正空白Abs10.750.2750.2170.8870.6340.4760.3770.166 Abs20.6540.2220.2040.7290
10、.560.530.3720.167 Abs30.8070.2250.2460.7770.6680.4380.3750.168黄酮含量(mmol 槲皮素/g)=C2V2/C1V1C2= (Y- 0.0387 )/ 0.743 mMV2=显色液的总体积。7mL。C1=样品液的初始浓度。如花椒叶为 5mg/mL。V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。7mL。例如:选取上面表格内 A1 Abs 值 0.75 减去空白对照吸光度平均值 0.167,得0.583,带入黄酮测定回归方程 y = 0.1743x + 0.0387 得:C2=3.12mM, 计算的黄酮含量=4.37 mmol 槲皮素/g。最后的
11、数据均为三次重复的平均值标准偏差。酸性染料比色法测定花椒总生物碱的含量酸性染料比色法测定花椒总生物碱的含量仪器与材料仪器与材料紫外一可见分光光度计(UV-1800 日本岛津);白屈菜红碱标准品(上海融禾医药科技发展有限公司,FW 348.37,白色结晶粉末, 99.26%),溴甲酚绿(天津博迪化工股份有限公司,FW 698.02,分析纯),磷酸二氢钠(天津博迪化工股份有限公司,NaH2PO42H2O, FW156.07,分析纯)磷酸氢二钠(天津博迪化工股份有限公司,Na2HPO412H2O, FW 358.14,分析纯)试剂配制:试剂配制:(1)pH 值为76的缓冲溶液的配制:02molLNa
12、H2PO4(130mL)和02moLLNa2HPO4(870mL),酸度计校正为76。(2)溴甲酚绿溶液的配制称取005g 溴甲酚绿加入磷酸缓冲液(pH 值=76),定容至100mL,制得溴甲酚绿缓冲液。(3)标准溶液的配制称取5mg 白屈菜红碱样品加入无水乙醇,定容至20mL,制得白屈菜红碱标准溶液(025mgmL)。操作步骤:操作步骤:标准曲线的绘制方法分别吸取1,2,3,4,5mL 对照品溶液,置于20mL 试管中,加水补至5mL。测定时,各吸取标液1mL(空白采用1mL 无水乙醇) ,依次加入溴甲酚绿磷酸缓冲液1mL 和5mL 氯仿溶液,振摇1min 后,倒入分液漏斗中静置60min,
13、分取氯仿层,在425nm 波长下测吸光度值,以生物碱含量(单位:mg/ML)为横坐标,吸光度值为纵坐标,做标准曲线。花椒生物碱含量测定:取花椒叶样液1mL,按照上述标曲方法,依次精密加入溴甲酚绿磷酸缓冲液1mL和5mL 氯仿溶液,振摇1min 后,倒入分液漏斗中静置1h,分取氯仿层,在425nm 波长下测吸光度值。将测得的吸光度值代人标准曲线。数据处理:数据处理:标准曲线:生物碱测定标曲制作原始数据:白屈菜红碱浓度 mg/mLAbs1Abs2Abs300.0650.0640.064 0.040.0910.0920.09 0.080.0950.0940.094 0.120.0980.0970.0
14、98 0.160.10.0990.104 0.20.1050.1050.105生物碱测定标曲制作原始数据的系统性描述95% 置信区间白屈菜红碱 浓度 mg/mLMeanStd. DeviationStd. ErrorLower BoundUpper BoundMinimumMaximum00.064 0.0006 0.0003 0.063 0.066 0.0640.065 0.040.091 0.0006 0.0003 0.089 0.093 0.090.092 0.080.094 0.0006 0.0003 0.093 0.096 0.0940.095 0.120.098 0.0006 0.
15、0003 0.093 0.099 0.0970.098 0.160.101 0.0010 0.0006 0.096 0.106 0.0990.105 0.20.105 0.0032 0.0019 0.103 0.109 0.1040.105回归方程及标准曲线:用表格内红色数据绘制,绘制时需减去空白溶液的吸光度值,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。y = 0.0858x + 0.0232;R = 0.9997计算公式:大红袍花椒叶 6 种洗脱相浸膏生物碱含量测定原始数据:ABCDEF空白1Abs0.230.2940.5020.5470.230.320.117 2 Abs0.1960.
16、3040.4950.5580.260.3170.122 3 Abs0.1910.2960.4970.5090.2710.320.203生物碱含量(mmol 白屈菜红碱/g)=C2V2/C1V1/348.37C2= (Y- 0.0232)/ 0.0858(mg/mL)V2=显色液的总体积(氯仿层)。10mL。C1=样品液的初始浓度。如花椒叶为 0.25mg/mL。V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。1mL。例如:选取上面表格内 A1 Abs 值 0.23 减去空白对照吸光度平均值 0.147,得0.083,带入生物碱测定回归方程 y = 0.0858x + 0.0232 得:C2=0.697 mg/mL, 计算得生物碱含量=0.08 mmol 白屈菜红碱/g。最后的数据均为三次重复的平均值标准偏差。花椒叶中总酚含量测定方法花椒叶中总酚含量测定方法前言:前言:大红袍花椒叶预处理,适当粉碎,称取 5g 花椒叶粉末, 80%冰丙酮100mL,4,提取 30min, 真空抽滤,收集滤液,残渣再次用 80