蛋白质和氨基酸的测定

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1、第十章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述一. 蛋白质概况蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织 的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白 质。人体内的酸碱平衡、水平衡的维持、遗传信息 的传递、物质的代谢及转运都与蛋白质有关。人及 动物只能从食品得到蛋白质及其分解物，来构成自 身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也 是是食品的重要组成之一。一个食品的营养高低， 主要看蛋白质含量的高低。蛋白质除了保证食品的 营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构等特 征上也起着重要的作用。（一）蛋白质组成与分类1 . 组成Composition蛋白质是复杂的含

2、氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽 键结合在一起的大分子化合物，它主要组成元素是C 、H、O、N、S、P。另外还有一些微量元素Fe、 Zn、I、Cu、Mn。对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质的 元素组成百分比。元素组成百分比：元素 C H O N S P百分比 50 7 23 16 0-3 0-3一般来说，蛋白质的平均含氮量为16%，所以在用凯氏定氮法定量蛋白质时，将测得的总 氮%乘上蛋白质的换算参数K=6.25即为该物质的蛋白质含量。2.按蛋白质的营养价值可将蛋白质分为 以下三类： 完全蛋白质：这是一种质量优良的蛋 白质，含有人

3、体必需氨基酸，并且所含种类 齐全，数量充足，比例合适，不但能够维持 人的生命与健康，而且能促进婴幼儿的生长 发育。如奶类中的酪蛋白、大豆蛋白及小麦 中的麦谷蛋白等，都是人体所必须的完全蛋 白质。 半完全蛋白质：此类蛋白质中，所含 必需氨基酸种类比较齐全，但含量低，相互 间的比例又不合适。如果在膳食中以它作为 唯一的蛋白质来源，可以维持生命，但不能 促进机体的生长发育。例如大麦、小麦中的 麦胶蛋白。不完全蛋白质：这类蛋白质中所含必需氨基酸的种类不全，如果在膳食中把它作 为唯一的蛋白质来源，既不能促进机体的生 长发育，也难以维持生命。例如玉米中的玉 米胶蛋白、豌豆中的豆球蛋白，动物结缔组 织和肉皮

4、中的胶原蛋白等。3 .食品中蛋白质的氨基酸组成上面我们已讲了蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物，目前各种氨基酸已 达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要 是其中的20种，按照-氨基酸侧链R基团的结构可分为：脂肪族类：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。羟基类：丝氨酸、苏氨酸酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸酰胺类：天冬酰胺、谷氨酰胺含硫类：半胱氨酸、蛋氨酸芳香族类：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸亚氨基酸：脯氨酸在构成构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙 氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨 酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠从食品摄入，故被称

5、为必需氨基酸 ，它们对人体有着极其重要的生理功能 。限制氨基酸：是指食物蛋白质中一种或几种必需氨基酸缺少或数量 不足，就会使食物蛋白质合成为机体蛋 白质的过程受到限制，亦即限制了此种 蛋白质的营养价值，这类氨基酸就称为 。按易缺少数量多少的顺序排列，称为第一限制氨基酸、第二等 等。如大豆第一限制氨基酸为蛋氨酸 。大米第一限制氨基酸为lys，第二限 制氨基酸为thr.评价某种蛋白质的营养价值包括两个方面：一是各种必需氨基 酸含量是否丰富，二是必需氨基酸的 构成是否符合一定比例。（二）各种食品中蛋白质的含量及测定 意义 1.含量由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不 均匀的，一般动物组织蛋白质含

6、量高于植物组织， 而且动物组织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植 物是以种子含量高，豆类含蛋白质最高。 如黄豆蛋白质含量在40%。 牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右， 猪肉 9.5%， 兔肉 21%， 鸡肉 20% ， 牛乳 3.5%， 带鱼 18.0%， 面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%， 苹果 1.4%2.测定意义测定食品中蛋白质的含量， 对于评价食品的营养价值，合理开发利 用食品资源、提高产品质量、优化食品 配方、指导经济核算及生产过程控制均 具有及其重要的意义。蛋白质 是评价食品质量高低 的指标，还关系到人体健康。如果膳食 中蛋白质长期不足，将出现负氮平衡， 也就是说

7、每天体内的排出氮大于抗体摄 入氮，这样造成消化吸收不良导致腹泻 等。但是摄入量过多会引起机体肝、肾 病变。二.蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即利用含氮量，肽键等测定蛋白质含量， 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基 团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分如碳水化合物，脂肪和维生素等干扰 成分很多，故蛋白质的测定最常用的方法是凯氏定氮 法。它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法 之一，在国内外应用普遍。由于食品中蛋白质含量不 同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它 们的基本原理都是一样的。

8、鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般的常规检验中多测定样品中的氨基 酸总量，通常采用酸碱滴定法测定。色谱技术的发展则为各种氨基酸的分离、鉴定及定量提供了有力的工具，近 年世界上已出现多种氨基酸分析仪，这使得 快速鉴定和定量氨基酸的理想成为现实。另 外利用近红外反射分析仪，输入各类氨基的 软件，通过电脑控制进行自动检测和计算， 也可以快速、准确的测出各种氨基酸含量。 下面分别介绍常用的蛋白质和氨基酸测定方 法。第二节 蛋白质的定量测定 关于氮-蛋白质换算系数对于氮含量换算成蛋白质含量的系数，历来采用6.25 ，这个数值是以蛋白质平均含氮而导出的数值，但是食品 中含氮的比例，因食品种类不同，差别是

9、很大的，我们在 测定蛋白质时，应该是不同的食品采用不同的换算等数， 一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查，蛋=6.25 ，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.83，玉米 =6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70，如果手册上 查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用的 换算等数以何物代替。对于用各种原料混合制成的食品，采用占总氮量多的 原料为换算系数，对于一些组成成分不明确的食品可采用 6.25，我们在作实验报告时，一定要注明所用的换算系数 。一、凯氏定氮法由Kieldhl于1833年提出， 现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半 微量法及改良

10、凯氏法,可应用于各类食品中 蛋白质含量的测定。这里只介绍前三种。（一）常量凯氏定氮法1. 原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳 和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品 中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵 。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。再用H3BO3 吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 消化 总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱 水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性，将有机物

11、炭化后 的碳氧化为二氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：2H2SO4 +CCO2+2SO2+2H2O二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧 化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留 在酸性溶液中。在消化反应中，为了加速蛋白质的分 解，缩短消化时间，常加入下列物质：加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提 高反应温度，一般纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾（ 1689 ）之后可以提高至400以上。原因主要在于随着消化过程中硫酸不断的被分解，水分不断逸出 而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下 ：K2SO4 +H2SO4 =2KHSO42KHSO4 K2SO4+H2

12、O+SO3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放 出氨而造成损失：（NH4）2SO4 NH3+（NH4）HSO42（NH4）HSO4 NH3+SO3+H2O也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点 ，但效果不如硫酸钾。加硫酸铜 作为催化剂。还可以 作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂 ）。硫酸铜的作用机理如下：C+ 2CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+22SO4 2CuSO4 +SO2+2H2O此反应不断进行，待有机物全部 被消化完后，不再有硫酸亚铜生成（褐色） ，溶液呈现清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催 化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，

13、以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。 除硫酸铜外还可以加氧化汞、汞（均有毒， 价格贵）、硒粉、二氧化钛等，应用最广泛 的是硫酸铜。加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等 加速有机 物氧化速度。但要防止氨进一步氧 化为氮。一般说来，若有足够的其他还原剂 ，如碳，则添加氧化剂不致使测定结果偏低 。目前使用双氧水较多，但必须注意须待消 化液完全冷却后再加入。仪器：凯氏消 化装置。100 页 要防止 爆沸。幻灯片 212. 蒸馏 消化液 + 40% 氢氧化钠加热 蒸馏，放出氨 气。幻灯片 223. 吸收与滴定 用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴 定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基 酚绿混合指示剂，国标用亚甲

14、基兰+甲基红 ）。指示剂 紫红色 绿色 淡紫红（酸） （碱） （酸）用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液 吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液 ，用甲基红指示剂。（pH4.86.0 红 黄 ）吸收滴定n操作步骤：准确称取固体样品0.20-2.00g （半固体25g，液体样品1020ml） 于500ml凯氏瓶中加10g无水 K2SO4加0.5gCuSO4加20ml H2SO4轻轻摇匀后连接消化装置，在 通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后 ，加大火力，消化至透明无黑粒后，将 瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中 继续消化至到样液呈蓝绿色透明时再 消化30分钟，停止消化，冷却加 200ml

15、水幻灯片 18连接蒸馏装置用硼酸作吸收液在 K氏烧瓶中加玻璃珠数粒和80ml40% NaOH摇动凯氏瓶至瓶内溶液变为深蓝色 或产生黑色沉淀，再加入100ml蒸馏水，夹紧 夹子加热蒸馏至氨全部蒸出（馏出液约 250ml即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸 馏水冲洗管口，继续蒸馏1分钟，以奈氏试剂检查馏出液，如无红棕色物生成，则蒸馏完 毕，可停止加热用0.1M HCl滴定至蓝色变为微红色即为终点。n2. 蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸 馏，放出氨气。 奈氏试剂Nessler试剂，K2（HgI4 ） 检验NH4+离子，遇铵根， 离子析 出黄色或红棕色沉淀。 配制方法1- 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于 70 毫升水。加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢 氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中 盖紧口。方法2- 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于 适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取 其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。n下面针对几点来说明影响氨化