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1、Mycosystema 菌 物 学 报 15 May 2008, 27(3): 474-481 ISSN1672-6472 CN11-5180Q 2008 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved. 丝状真菌细胞凋亡研究方法 林琳 姜俏 汪天虹* 山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 250100 Research methods for apoptosis of filamentous fungi LIN Lin JIANG Qiao WANG Tian-Hong* State Key Laboratory of Microb
2、ial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China 细胞凋亡作为细胞调控机制之一，与细胞增殖、细胞分化同等重要，在进化上具有保守性。细胞周期和凋亡通路的失调能引发多种人类疾病，是目前生命科学领域活跃的研究方向（Gougeon 2003；Brown & Attardi 2005） 。由于丝状真菌细胞凋亡的表型和生理特征与动物细胞相似，而且细胞结构和代谢过程简单，用作模式生物既可以简化凋亡模型又可以探究凋亡核心通路。因此，掌握丝状真菌细胞凋亡的检测方法非常必要。丝状真菌细胞结构与动物细胞不同，使丝状真菌细胞凋亡在检测方法和步骤上具有独特
3、性。例如：凋亡时，丝状真菌细胞原生质体凝缩并产生大量液泡，利用该表型特点可对细胞凋亡进行初步判断（Frhlich & Madeo 2000） 。在进行凋亡鉴定时，染料不容易透过丝状真菌细胞壁，因此需要制备原生质体或进行菌丝原位破壁。原生质体通常来源于不同生长时期的菌丝，其菌龄、活力、生长状态等都不同，因此如何表征原生质体活力将成为下一步研究的重点。与酵母类似，在丝状真菌凋亡过程中没有发现 DNA ladder 现象，需要通过其他方式鉴定DNA 片断化。本文对开展丝状真菌细胞凋亡研究时常用的检测方法，包括其原理、特点、基金项目：国家自然科学基金（No. 30470052，No. 30670029
4、） ；国家重点基础研究规划项目（973） （No. 2003CB716006，No. 2004CB719702） *Corresponding author. E-mail: 收稿日期：2007-09-21，接受日期：2007-11-27 Vol.27 No.3 475 http:/ 操作步骤，以及相对于哺乳动物细胞凋亡检测方法的改进等诸方面进行了阐述。 1 菌丝生长与活力检测 凋亡作为一种细胞死亡过程，检测细胞生长（growth）和活力（viability）是研究的必要准备。与动物细胞类似，真菌细胞活力检测常用的方法有伊文思蓝（Evans blue）染色，噻唑蓝染色（MTT） ，平板计数法
5、（Colony forming unit，CFU）等，其中平板计数法是最可靠的方法。 伊文思蓝（Evans blue）是一种检测细胞死活的染料。其原理在于伊文思蓝不能透过健康细胞的完整细胞膜，但当细胞死亡时能够渗入破损细胞膜染色。Chen & Dickman（2005）使用该方法检测了脯氨酸对三叶草刺盘孢 Colletotrichum trifolii 凋亡的抑制作用，在缺乏脯氨酸的基本培养基上诱导显性活化致癌基因 Ras（dominant activated “oncogenic” Ras，DARas）突变株，6d 后，用 0.4%伊文思蓝染液处理突变株菌丝，24h 后在光镜下鉴别细胞的死活
6、状态。 噻唑蓝（MTT） ，全称 3-(4, 5-二甲基噻唑)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4, 5-dimethylthiozol -2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide） ，是一种氧化还原指示剂，可作用于电子传递链并能反映其完整性，是细胞死亡的早期指标。MTT 呈黄色，氮蓝四唑（tetrazolium）在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下开环，生成蓝色的甲臜（formazan）结晶。但死亡细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原，因此该反应与活细胞数目成正比（Altman 1976） 。还原生成的甲臜结晶溶解后，经分光光度计分析可以估计出
7、线粒体量，从而反映出活细胞数目（Denizot & Lang 1986） 。 平板计数法用于统计菌落形成单位（colony forming units，CFU） ，即平板上生成的活菌数量。几乎所有丝状真菌细胞凋亡检测都用到平板计数的方法。如 Mousavi 等（2003）通过对进入静止期（stationary phase）后的烟曲霉 Aspergillus fumigatus 细胞进行平板计数，检测到细胞活力的急剧下降。目前，平板计数法是鉴定丝状真菌细胞生死的方法中最可靠的（Teparic et al. 2005） 。需要注意的是，由于在菌落中常能同时发现死细胞和活细胞，所以需要显微镜辅助观察
8、来获取精确的数据。 2 电镜观察超微结构 在凋亡验证方法中，电子显微镜观察能提供最可靠的证据。通常情况下，在电镜观察前，细胞需要经过润洗、固定、染色、固定、清洗、脱水等繁琐的步骤。在电镜观察时，丝状真菌凋亡细胞的明显特征为染色质凝聚、DNA 断裂以及出现凋亡小泡等现象。此外，在丝状真菌细胞凋亡过程中均能观察到“细胞质片断化” （fragmentation of the cytoplasm）的现象。 其原因可能是由于凋亡过程中产生了大量液泡 （Marek et al. 2003） 。 笔者采用 H2O2诱导瑞氏木霉 Trichoderma reesei 细胞凋亡过程中也观察到类似的原生质体液泡化
9、现象 （实验结果另文报道） 。Phillips 等（2003）使用不同浓度乙酸诱导白假丝酵母 Candida albicans细胞凋亡时发现在乙酸浓度较低时，透射电镜显示凋亡细胞染色质聚集，周边存在空泡；476 Mycosystema 乙酸浓度高时， 坏死细胞呈现出细胞器肿胀， 细胞膜破损等现象。 虽然电镜观察步骤繁琐、成本较高，而且只能定性不能定量；但由于能观察到特异的凋亡表型特征，被公认为检测细胞凋亡最可靠的方法，是凋亡检测的金标准。 3 ROS 生成检测 在动物和酵母细胞中，线粒体活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）的生成已经成为细胞凋亡的证据之一。在丝状
10、真菌中，绝大多数细胞凋亡反应都依赖于 ROS 的作用。二氢罗丹明 123（dihydrorhodamine 123，DHR123）是检测 ROS 生成最快最有效的方法。此外，利用氧化剂敏感型探针 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸盐（H2DCF）检测 ROS 的方法也得到了广泛的应用。ROS 产生时能将二氯二氢荧光黄双乙酸钠（DCFH-DA）氧化成显示绿色荧光的 DCF， （Chen & Dickman 2004） ，并且荧光强度与细胞内 ROS 的含量成正比。Hempel 等（1999）通过比较 H2DCF，5,6-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二乙酸盐和DHR123，发现二氢荧光素对细胞内氧化物质
11、的检测要优于 DHR123。 Phillips 等（2003）在研究环境压力和两性霉素 B（amphotericin B）诱导白假丝酵母Candida albicans 细胞凋亡时，用 DHR123 成功地检测了细胞中 ROS 的生成，而 Chen 和Dickman（2005）将三叶草刺盘孢菌 Colletotrichum trifolii 原生质体与 DCFH-DA 共同孵育来观察生成的 ROS。Ito 等（2007）在番茄皂苷 -番茄素诱导非致病性镰刀菌 Fusarium oxysporum 细胞凋亡研究中，也是使用 DHR123 检测到 ROS 的生成。鉴于 ROS 的化学反应活泼性使
12、ROS 检测成为最快捷、简单的凋亡检测方法，而且成本比较低，因此在进行细胞凋亡鉴定时，ROS 检测是优先使用的鉴定方法。 4 annexin V 检测磷脂酰丝氨酸外翻 在真核细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）通常只分布在细胞质膜内表面细胞质基质一侧。当细胞发生凋亡时，质膜失去不对称性（membrane asymmetry） ，磷酯酰丝氨酸外翻至细胞膜外侧。 这种 PS 外翻现象可作为凋亡早期的敏感标记 （Martin et al. 1995） 。annexin V 是钙离子依赖型的磷酯结合蛋白，在 Ca2+参与下能专一性结合 PS。用异硫氰酸荧光素（fluore
13、scein isothiocyanate，FITC）或藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记annexin V，即可在荧光显微镜下显示 PS 外翻现象。 丝状真菌进行 annexin V 染色前要制备原生质体，因此需使用 4, 6-二氨基-2-苯基吲哚（4, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色鉴定原生质体是否具有细胞核。DAPI 是一种蓝色的荧光染料，能插入到 DNA 双链中，反应与溴化乙啶（ethidium bromide，EB）类似。DAPI 结合后产生的荧光比自身荧光高 20 多倍，灵敏度高。经 6d 培养后的 DARas 突变细胞用 70%
14、（v/v） 乙醇溶液固定， 然后， 加入 1g/mL 的 DAPI/PBS 溶液， 室温下孵育 15min，用 PBS 清洗两次后在表面荧光显微镜下鉴别原生质体细胞核的情况（Chen & Dickman 2005） 。由于原生质体比较脆弱，实验操作本身可能导致原生质的机械性坏死，因此需要通过 annexin V 和 PI 联合标记排除干扰。目前 annexin V 是丝状真菌细胞凋亡常用的检测Vol.27 No.3 477 http:/ 方法。如 Mousavi 等（2003）在烟曲霉 Aspergillus fumigatus 中使用 annexin V 检测到了 PS外翻现象。而 Chen
15、g 等（2003）对构巢曲霉 Aspergillus nidulans 的细胞凋亡研究中联合使用 annexin V 和 PI，发现部分细胞的 annexin V 和 PI 反应同时呈阳性，说明在非凋亡的细胞中也可能出现 PS 外翻。单独使用 annexin V 可能造成结果假阳性，这一点在检测初期需要格外注意。需要指出的是，虽然 annexin V 是常用的细胞凋亡检测方法，但并非所有的凋亡细胞都具有 PS 外翻现象，如某些动物细胞即不具有该表型。因此，如果没有观察到PS 外翻也并不能表明没有发生细胞凋亡，需要用其他手段进一步鉴定。 5 TUNEL 检测染色质片断化 动物细胞凋亡过程中，被激活的某些 DNA 内切酶，在核小体连接区处切断染色质，形成核小体的整数倍片断，在琼脂糖电泳图上呈阶梯状分布，即 DNA ladder 现象。但包括酵母在内的所有真菌中，目前仅在总状毛霉 Mucor ra
