《UPA，PAI-1在结直肠癌血浆中的测定及其临床意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《UPA，PAI-1在结直肠癌血浆中的测定及其临床意义（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、上海交通大学硕士学位论文UPA，PAI-1在结直肠癌血浆中的测定及其临床意义姓名：沈倩雯申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：金冶宁20080501上海交通大学上海交通大学 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密保密，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文
2、作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 上海交通大学医学院硕士学位论文 -1- UPA,PAI-1 在结直肠癌血浆中的测定 及其临床意义 UPA,PAI-1 在结直肠癌血浆中的测定 及其临床意义 摘 要 目的：探讨 UPA,PAI-1 在结直肠癌血浆中的浓度变化，及其作为肿瘤指标的临床应用价值。 方法： 使用 Elisa 方法测定 20 名健康对照组人群血浆 UPA,PAI-1 浓度，以及 48 例结直肠癌患者治疗前血浆 UPA,PAI-1 浓度（其中 22 人追踪测定术后血样浓度） 。同时期测定血清 CEA 浓度。 结果：UPA、PAI-1 在 48 例结直肠癌患
3、者血浆中的浓度明显高于对照组(P=59 26 52.08 9 45.0 =59 26 52.08 9 45.0 基本情况 术前 局部复发 远处转移 29 5 14 60.42 10.42 29.17 基本情况 术前 局部复发 远处转移 29 5 14 60.42 10.42 29.17 Duke 分期 A 期 B 期 C 期 D 期 7 10 10 21 14.58 20.83 20.83 43.75 Duke 分期 A 期 B 期 C 期 D 期 7 10 10 21 14.58 20.83 20.83 43.75 病理类型 管状腺癌 2 级 管状腺癌 2-3 级 管状腺癌 3 级 粘液腺癌
4、 印戒细胞癌 乳头状腺癌 33 6 4 3 1 1 68.75 12.50 8.33 6.25 2.08 2.08 病理类型 管状腺癌 2 级 管状腺癌 2-3 级 管状腺癌 3 级 粘液腺癌 印戒细胞癌 乳头状腺癌 33 6 4 3 1 1 68.75 12.50 8.33 6.25 2.08 2.08 1.21.2 主要实验仪器： 主要实验仪器： 酶标仪（DENLEY DRAGON Wellscan MK 2） ：Thermo 公司产品，产地： 芬兰；分上海交通大学医学院硕士学位论文 -10- 析软件： Ascent software for Mltiskan。 数字显示隔水式电热恒温培养
5、箱（PYX-DHS）为上海跃进医疗器械厂产品。 离心机Eppendorf centrifuge 5810R：德国Eppendorf公司。 离心机Beckman CoulterTM microfuge 22R centrifuge：美国Beckman Coulter公司。 2.2. 实验方法 2.1 血浆样本采集 实验方法 2.1 血浆样本采集 所有患者于手术前或化疗前，在晨起空腹时（禁食12小时以上）抽取全血3ml，置入3.2%枸橼酸钠抗凝管。4保存。于24小时内离心，取上清液分装后即置于-80冰箱保存待测。术后的血浆样本均在患者术后6-8w采集（第一次辅助化疗前） 。健康对照组血浆随机选择2
6、0例，与空腹情况下抽血。处理同前 2.2 实验室指标测定 2.2 实验室指标测定 一、UPA 定量 ELISA 测定步骤 准备试剂 洗涤液：用双蒸水 1:20 稀释 2. 标准品及样品准备：分别标记标准品，样品编号。将标准品，样品各 300ul移入备用 96 孔板。准备 8 排管移液器备用。 检测步骤 1. 建立标准曲线： 抗体包被的微孔板上设标准孔 7 孔 （A1G1） ， 按 0， 0.5， 1.0，2.5，5.0，10，25ng/ml 的浓度顺序，每孔中各加入标准品 100l。H1 孔为上海交通大学医学院硕士学位论文 -11- 空白对照。 2. 加样：待测样品孔中每孔加入待测样品 100
7、l。 （使用 8 排的移液器在 5分钟内加样完成） 3. 在标准品孔和样品孔中加入 50ul 酶标记偶合液。轻柔摇晃 15 秒 4. 将反应板置 37水浴 60 分钟。 5. 洗板： 用洗涤液将反应板充分洗涤 5 次， 每次静置 10-20 秒。 向滤纸上印干。 6. 每孔中加入底物 A、B 各 50l。 7. 37下避光孵育反应 15 分钟 8. 每孔加入 50ul 终止液，终止反应 9. 轻摇 30 秒，使充分混合变色 10. 30 分钟内在 450nm 处测吸光值 计算结果 1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行计算。 2. 以标准品 0，0.5，1.0，2.5，5.0，10，25ng
8、/ml 之 OD 值在半对数纸上作图，画出标准曲线。见图 1-1 3. 根据样品 OD 值在该曲线图上计算出相应血浆 UPA 含量。 S = 0.01539218 r = 0.99830400X Axis (units)Y Axis (units)0.04.69.213.818.322.927.5-0.31-0.17-0.040.100.240.370.51图 1-1 血浆 UPA 测定标准曲线 二、PAI-1 定量 ELISA 测定步骤 准备试剂 上海交通大学医学院硕士学位论文 -12- 1. 洗涤液：如果晶体生成，在室温中暖化并轻柔摇晃使之溶解。将 20ml 洗涤剂稀释成 500ml 洗涤
9、剂 2. 反应物 A,B 以等体积混合，在使用前 15min 内，避光。 3标准品：用 1ml 蒸馏水稀释。使之浓度 200ng/ml。搅拌之后静置至少 15min使之充分混匀。吸取 100ul 上述液体入管，吸取 900ul 标准品稀释剂加入形成第一个标准浓度（20ng/ml 管） 。剩下空的每管加入 500ul 稀释液。从 20ng/ml 管开始，依次移取 500ul 入后管。形成 10，5，2.5，1.25，0.625，0.312ng/ml 标准品 4标准品及样品准备：分别标记标准品，样品编号。将标准品，样品各 300ul移入备用 96 孔板。准备 8 排管移液器备用。 检测步骤 1.
10、每孔中加入 50ul 试验稀释剂 RD1-57 2. 加样：待测样品孔中每孔加入待测样品或标准品 50l。留空白孔 2 个（在15 分钟内完成） 3. 反应板置室温孵化 120 分钟。 4. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4 次，向滤纸上印干。 5. 每孔中加入丝氨酸 E1/PAI-1 结合物 200l。 6. 将反应板充分混匀后置室温孵化 120 分钟。 7. 洗板：同前。 8. 每孔加底物 200l。 9. 将反应板置室温避光孵化 30 分钟。 10. 每孔加入 50ml 终止液混匀。 11. 30 分钟内在 492nm 处测吸光值。 计算结果 1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行计
11、算。 上海交通大学医学院硕士学位论文 -13- 2. 以标准品 0，0.312，0.625，1.25，2.5，5，10，20ng/ml 之 OD 值在作图，画出标准曲线。见图 1-2 3. 根据样品 OD 值在该曲线图上计算出相应血浆 PAI-1 含量。 S = 0.06514872 r = 0.99569835X Axis (units)Y Axis (units)0.03.77.311.014.718.322.00.000.350.701.041.391.732.08图 1-2 血浆 PAI-1 测定标准曲线 2.3 患者随访： 2.3 患者随访： 与 2008 年 4 月电话随访，病人是
12、否进展，复发，死亡基本情况。 3统计学分析 3统计学分析 所有的数据资料用 SPSS13.0 软件包处理， 结果用均数标准差表示。 由于采集样本之数据离散程度较大，故 UPA,PAI-1 水平在各临床病理特征见的分析用Druskal-Wallis H 检验,手术前后数据比较用 Wilcoxon signed rank test、相关分析采用 Spearman 秩相关。统计学差异以 P0.05 计算。所有 P 值均为双侧。试验结果数据的表述使用中位数 median 和数值范围 range 描述。 上海交通大学医学院硕士学位论文 -14- 结 果 结 果 血浆UPA,PAI-1水平在健康对照组，远
13、处转移，局部复发，以及各临床分期患者间的差异： 血浆UPA,PAI-1水平在健康对照组，远处转移，局部复发，以及各临床分期患者间的差异： 在48例结直肠癌患者血浆中测定UPA、PAI-1浓度。结果见表2-1、表2-2。分析所有48名结直肠癌患者，UPA，PAI-1在患者血浆中的值分别为median 1.36ng/ml range0.63 -2.80 ng/ml，和median 11.54 ng/ml range5.91-22.37 ng/ml,明显高于对照组（UPA: median 0.69 ng/ml ange0.44-1.03 ng/ml 和PAI-1 median 4.74 ng/ml
14、range1.45-12.69 ng/ml。详见图2。血浆UPA、PAI-1均有随着患者DUKES分期升高而上升的趋势。其中，对于UPA来说，DUKES C、D期患者明显高于DUKES A B者,有显著性差异(P=59 13 16 44.8 55.2 1.17 1.38 0.63-2.22 0.84-2.170.303 0.195 0.311 淋巴结浸润 阴性 阳性 18 11 62.1 37.9 1.16 1.45 0.63-1.81 1.06-2.220.0170.45 0.014浸润深度 粘膜内 肌层 浆膜内 浆膜下 2 7 8 12 6.9 24.1 27.6 41.4 1.11 1.
15、17 1.32 1.43 0.86-1.36 0.63-1.93 0.86-1.73 0.84-2.220.632 0.237 0.216 病理类型 管状腺癌中 分化 管状腺癌中 低分化 管状腺癌低 分化/印戒 细胞癌 20 5 4 65.5 20.7 13.8 1.22 1.55 1.76 0.63-1.810.97-2.221.36-2.170.0150.548 0.002肿块大小 直径3cm 8 21 27.6 72.4 0.93 1.36 0.63-2.22 0.86-2.170.075 0.337 0.074 肿块部位 结肠 直肠 10 19 34.5 65.5 1.43 1.34
16、0.90-2.22 0.63-1.930.291 -0.20 0.299 DUKES 分期 A 期 B 期 C 期 D 期 7 9 10 3 24.1 31.0 34.5 10.3 1.16 0.99 1.43 1.81 0.63-1.36 0.84-1.65 1.06-2.22 1.22-2.270.0430.538 0.003上海交通大学医学院硕士学位论文 -20- 表 3-2 初发患者 29 个病例其各种临床病理特征所对应的 PAI-1 血浆浓度 人数 % 中位数 (ng/ml)范围 (ng/ml) P R P 总体 29 11.01 5.91-21.05 性别 女 男 13 16 44.8 55.2 12.75 10.12 5.91-21.05 6.99-13.160
