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1、At h e s i s ( d i s s e r t a t i o n ) s u b m i t t e dt oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o r t h ed e g r e eo fM a s t e r ( d o c t o r )Ap r e l i m i n a r ys t u d yo ft h ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fM i R 4 4 9 a ba n dN o t c hli nN S C L Ct i s s u e sB yC a i h
2、u aY a nS u p e r v i s o r ：X i a o b i n gC h e nT h em a s t e ro fC l i n i c a lm e d i c i n e ( I n t e r n a lM e d i c i n e )t h eA f f i l i a t e dC a n c e rH o s p i t a lo fZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yM a r c h ，2 0 1 4原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外
3、，本论文不包含任何其它个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者易及中辞日期：厶，僻乡月莎R学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其它复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，
4、第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：另灸璐日期：加牌月岁日摘要M i R - 4 4 9 a b 与N o t c h l 在N S C L C 组织中表达及其调 控机制研究硕士研究生颜才华导师陈小兵郑州大学附属肿瘤医院河南郑州4 5 0 0 0 0摘要目的：研究N o t c h l 与m i R - 4 4 9 a b 在肺癌组织中的表达，并通过对两者相关性的分析，以初步探讨m i R 4 4 9 a b 与N o t c h l 的靶向调控关系。方法：以N S C L C 患者术后新鲜癌组织与配对的癌旁组织为研究对象，分别通过w e s t e r n
5、b l o t 、R T - P C R 技术检测肺癌组织及癌旁组织中N o t c h l 的表达，并通过q R T - P C R 检测肺癌组织中的m i R - 4 4 9 a b 表达，分析其与N o t c h l 的相关性。同时利用生物学分析和预测m i R 4 4 9 a b 的调控关系，并进行双荧光素酶实验验证。结果：在9 0 例组织样本中，癌组织中N o t c h l 表达阳性率为7 3 3 ，在癌旁组织中为3 0 ，差异具有统计学意义( P ；n霞。研弼12一u了_1o；眄一。叱讨论讨论随着肿瘤分子水平研究的不断深入，对肿瘤发生发展机制的不断研究，肿瘤的发生、发展是一个多
6、因素参与的复杂过程。既往大量研究表明，N o t c h 等信号通路与肿瘤的存在密切相关。N o t c h l 更是做为肿瘤领域近年来的研究热点备受关注。异常N o t c h l 表达在肿瘤细胞的生长、代谢、细胞周期及凋亡等过程发挥关键作用。lN o t c h l 与肺癌N o t c h 作为作为高度保守的信号通路，在肺形成的早期即丌始表达。近年来针对N o t c h 的研究已成为热点，N o t c h 信号通路在不仅在F 常细胞的生长、分化、凋亡中发挥作用，而且在肿瘤细胞的发生、发展中扮演重要的调控作用。N o t c h l作为最被关注的受体成员之一，研究显示其在肺癌等恶性肿瘤
7、的发生、发展及预后中发挥重要作用【3 6 1 。在过去的十年，新的证据已证实，N o t c h 信号通路参与调控肺发育以及肺的病理分型。N o t c h 信号促进早期近端细胞命运，它能够调控气道上皮细胞分化为具体的谱系( C l a r a 细胞与纤毛细胞、神经内分泌细胞与非神经内分泌细胞) 。在病理情况下，如慢性阻塞性肺病、纤维化和肺癌，N o t c h信号可能通过调节干细胞活性、细胞分化以及细胞增殖发挥其促凋亡作用，肺发育过程中让人联想到它的作用。N o t c h 信号通路表现出肿瘤异质性，其抑癌或促癌作用取决于肺肿瘤的类型。对N S C L C 的相关研究中显示N o t c h
8、 信号传导上调，并且可以促进肿瘤细胞增殖，而N o t c h 表达在S C L C 中未显示出明显上调，并且可能抑制肿瘤生长。截止目前，N o t c h 信号通路与肺癌的相关研究中，以细胞株层面多见，而在N S C I 。C 组织中的研究较少。在细胞株层面的研究中，Z h e n gQ 等f 3 7 】通过诱导肺腺癌细胞株A 5 4 9 中活化形式的N o t c h l 胞内段( N I C ) 的过表达，以评估N o t c h 信号在肺癌中的作用。结果显示，N I C 过表达的A 5 4 9 细胞中，肿瘤细胞生长受抑，提示N o t c h 信号在肺腺癌细胞中发挥抑癌作用。除此之外，
9、C h e n Y 等【3 8 】研究发现氧浓度决定N o t c h l 在肺腺癌中的生物学效应，即在正常氧浓度条件下，N o t c h l 对肺腺癌细胞株起抑癌作用；而在缺氧状态下，N o t c h l 对维持细胞存活起重要作用。2 1讨论众所周知，肺肿瘤细胞在体内处于缺氧的状态，在通过与肺的其他正常组织类比分析中发现，肺肿瘤细胞中N o t c h 信号( 特别是N o t c h l ) 的表达显著增高，同时N o t c h 的这种高表达可通过Y 分泌酶抑制剂( Y s e c r e t a s e ) 或小分子干扰R N A( s i R N A ) 抑制。此外该研究还证实了
10、Y 一分泌酶抑制剂诱导的凋亡细胞可被活化的N o t c h l 逆转。进一步提示N o t c h l 在肺癌发生发展中的重要作用。本实验随机收取肺癌患者癌组织及配对癌旁组织标本，检i 贝1 N o t c h l 蛋白表达情况，结果显示N o t c h l 蛋白在肺癌组织中较癌旁组织中高表达，继而检测N o t c h lm R N A 表达水平，结果与蛋白表达水平相一致，提示在肺癌组织中，N o t c h l 表达水平高于癌旁组织，可能与肿瘤的发生发展密切相关。另外，通过采集并统计分析患者临床病理特征，我们发现，在肺鳞癌组织中N o t c h l 蛋白表达阳性率显著高于肺腺癌，差异
11、具有统计学意义，提示N o t c h l 在肺癌患者组织学分型有关，可能与肺癌细胞分化具有密切关系，这与文献中报道的N o t c h 参与肺癌干细胞多能分化相一致。同时，我们还发现N o t c h l 的高表达在I 、I I 期肺癌患者中较为明显，在I I I 、I V 期患者中则无明显高表达，甚至是呈低表达，我们猜想N o t c h l可能主要在肺癌细胞的早期分化方面发挥重要作用。既往文献表明，在肺癌干细胞的发生、发展中N o t c h 信号通路发挥关键作用：在气管干细胞的研究方面，M aX B 等【3 9 】通过在大鼠的损伤模型中阻断N o t c h 信号，可以减少增殖细胞核抗
12、原和A T P 转运蛋白，并且可以上调细胞角蛋白1 9 的表达，但N o t c h 信号通路若持续激活则可以出现相反的结果，以上结果表明N o t c h 信号通路在维持气管干细胞的未分化状态及促进非分化性中扮演重要作用；在肺发育的相关研究方面，N o t c h 信号通路的活化与其密切相关。C o l l i n sB 等【4 0 】发现N o t c h 配体、受体及H E S l在N S C L C 干细胞中表达升高。调控呼吸道上皮细胞分化的相关研究方面，n oT等【4 l l 发现小鼠中N o t c h l 、N o t c h 2 - N o t c h 3 、N o t c h
13、 4m R N A d e r 表达随着年龄增加而增加。神经分泌小体会随着N o t c h 的激活抑制而出现无序、提前的分化。在肺癌的多数细胞系中，K o n i s h i 等 4 2 1 研究显示Y S e e r e t a s e 抑制剂可通过抑$ 1 N o t c h信号通路，从而导致癌细胞的死亡和生长抑制。2m i R N A 与肺癌m i c r o R N A ( 微d 、R N A 亦称m i R N A ) 作为近年来的研究热点，在肿瘤领域的作用亦不容忽视。一方面可以在转录后水平通过促进靶基因m R N A 降解，从而起讨论到负调节基因表达的作用，广泛参与生物发育、细胞
14、分化和肿瘤发生等各种生物学进程。近年来，对m i R N A L e t 7 已较为成熟。肺癌中m i R N A L e t 7 的稳定低表达是与肺癌相关m i R N A 研究的重要发现之一，与肺癌的发生发展密切相关。在细胞株层面，在L e t - 7 与肺腺癌细胞株的研究发现，L e t 7 的过度表达可以抑制细胞增殖以及成瘤速率【4 3 1 。相反，抑带l l L e t 7 能增强细胞增殖【州。随着研究的深入，越来越多的研究表明其它m i R N A 在肺癌的发生发展中同样起到重要的作用。如在白血病中通常高表达的m i R 1 5 1 6 ，但是在肺癌中却常低表达。另外，在肌肉组织中
15、表达丰富的m i R 1 和m i R 1 3 3 b ，但在肺癌中表达通常显著降低。除了能调节肺癌细胞增殖和凋亡，并在肿瘤的早期筛查、诊断、及肿瘤分期及预后预测等方面发挥重要作用。2 1m i R N A 与肺癌的早期诊断对于肺癌高危人群，检测其血清中相关m i R N A 可用于肺癌的筛查。B o e f i 等【4 5 】通过采用螺旋C T 对吸烟人群进行肺癌筛查，同时对筛查出的肺癌患者进行诊前、后的血样采集，发现螺旋C T 未提示影像学异常时，血浆m i R N A 对于肺癌的早期诊断灵敏度为9 0 ，特异度9 0 ；而C T 影像学异常时，血浆m i R N A 的肺癌诊断的灵敏度为
16、7 5 ，特异度1 0 0 。提示肺癌的早期诊断中m i R N A 具有重要的价值。K e l l e r 等【4 6 】通过对确诊的N S C L C 患者前、后血清标本与正常对照血清对比检测，发现m i R 16 、m i R 5 7 4 5 p 、m i R 12 2 8 及m i R 6 6 3 等1O 个血清m i R N A 表达谱用于早期N S C L C 的诊断。此外，F o s s 等【47 】报道显示，可早于临床诊断前数月检测到血清m i R 1 2 5 4 和m i R 5 7 4 5 p 的异常表达，其肺癌的早期诊断敏感度和特异度分别为8 2 和7 7 。S h e n 等【4 8 】也报道了，N S C L C 患者和健康人群的区分可通过联合检i 贝J m i R 2 1 、m i R 1 2 6 、m i R 2 1 0 、m i R 4 8 6 5 p 4 种m i R N A 实现，且其特异性高达9 6 5 5 ，灵敏性为8
