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1、DNA 提取提取方案一：手磨提取方案一：手磨提取杉木基因组 DNA 的提取1)在 l0mL 离心管中加入 3mL 2xCTAB 提取缓冲液，650C 水浴预热:2)材料 1g,剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧 烈摇动混匀，650C 水浴保温 45min，其间摇动 2 次:3)加入等体积的氯仿/异戊醇(24: 1)溶液，颠倒混匀，室温下静置 5-l0min,使 水相和有机相分层:4)室温下 11000rpm 离心 l0min;5)仔细移取上清液至另一个 l 0mL 离心管: 6)重复 4-5 步骤二至三次;（具体次数示抽取效果而定，标准是两相间分层 界面没有或少有白色蛋白
2、漂浮物）7)仔细移取上清液至另一个 l0mL 离心管，加 2 倍体积的冰乙醇，上下颠倒， 室温静置 5-10min（或加入 1.5 倍体积异丙醇(预冷)，混匀，-200C 放置 2-3h） 8) 40C11000rpm 离心 l0min(如果沉淀很多，可用带够的毛细管直接勾出。9)弃上清，用 75%的预冷乙醇洗涤两次，自然风干沉淀，加适量（100ul） 的 ddH20 溶解沉淀。 试剂配方2XCTAB 提取缓冲液:CTAB 20g/LPVP 2.5%NaCI 1.4mo1/LEDTA(pH=8.0) 20mmo1/LTris -C1(pH=8.0) 100mmo1/L琉基乙醇 2%(用前加入)
3、方案二：机磨提取方案二：机磨提取1)把材料剪碎，放入 2mL 离心管中（大约 1/3 的管体积） ，每管放入钢珠（一大四小） ，然后整管放到液氮中保存（等其他样本准备好后，一起研 磨） 2）把样管放入配置器中， （两个配置器两边一定要平衡，配置器用前放入-200C 预冷） 。并用液氮速冻。 3）用研磨仪，两边平衡，28Hz, 2min15s。 4)在 2mL 离心管中加入 1mL 2xCTAB 提取缓冲液，剧烈摇动混匀，650C 水浴保温 45min，其间摇动 2 次:5）把样管离心（2500rpm,1min） ，取上清到新管中。 6)加入等体积的氯仿/异戊醇(24: 1)溶液，颠倒混匀，室温
4、下静置 5-l0min,使 水相和有机相分层:7)室温下 11000rpm 离心 l0min;8)仔细移取上清液至另一个 2mL 离心管: 9)重复 4-5 步骤二至三次;（具体次数示抽取效果而定，标准是两相间分层 界面没有或少有白色蛋白漂浮物）10)仔细移取上清液至另一个 2mL 离心管，加 2 倍体积的冰乙醇，上下颠倒， 室温静置 5-10min（或加入 1.5 倍体积异丙醇(预冷)，混匀，-200C 放置 2-3h） 11) 40C11000rpm 离心 l0min(如果沉淀很多，可用带够的毛细管直接勾出。12)弃上清，用 75%的预冷乙醇洗涤两次，自然风干沉淀，加适量 （100ul）的
5、 ddH20 溶解沉淀。DNA 质量要求（质量要求（127 与与 144 号号 DNA 为参照）为参照）经分光光度计检验， ，本试验中各样品的 DNAOD260/OD230 值均在 1.8 以 上，表明蛋白质等杂质均较少，DNA 纯度较高，OD260/OD280 值均在 1.7-2.0 之间。据一般物种的 SSR 反应体系的要求，DNA 在 30-100ng/ul 均可满足 SSR- PCR 的要求。 （如 DNA 浓度高的话，可加水稀释至合适浓度） 。或经 1%琼脂糖检验。SSR 引物引物引物Tm 3654 3850 5455 8755 9348 9854 10054 14354 24949
6、 29749 22053 35350 41850反应程序：94预变性 5min; 94变性 45S，Tm+10退火 45S，每个循环下降 0.5 72延伸 1min. 20 个循环: 93变性 45s，50退火 45s，72延伸 1min，20 个循环；72 延伸 l0min， 最后 4 保温。反应体系：10ul 体系 Buffer：1ul Mg：0.5ul dNTP：0.2ul P1:0.2ul P2:0.2ul DNA: 60ng 左右 Tap：0.1ul 水（灭菌）补齐至 10ul。PCR 产物检验产物检验10%聚丙烯酰胺凝胶配制 1) 10%丙烯酰胺聚丙烯酰胺的配制(500mI):称取
7、 210g 尿素，1g 甲叉，49g 丙 烯酰胺，加入 500mI 烧杯中，加入少量水和 10TBE 50mI。用搅拌器搅拌均 匀，用微波炉加热 4 次。直到透明无杂质。用双蒸水定容到 500mI,溶后，4 冰箱避光保存。 2) 10TBE 配制:称取 54gTris 碱，27.5g 硼酸，20m1 0.5M EDTA(pH=8.0)。 加入双蒸水 600m1 搅拌均匀，最后用双蒸水定容到 1L。 3)显影液的配制:称取 NaOH 1 5g,l0m1 0.756%四硼酸钠和 10ml 甲醛，用双蒸 水定容到 1L,在室温保存。 4)固定液的配制:称取 200ml 无水乙醇和 10ml 乙酸，加
8、入 2L 烧杯中，用双蒸 水定容到 2L。 5 ) AgNO3原液的配制:称取 AgNO37.5g 溶解到 50ml 双蒸水中。将 2500ulAgNO3原液加入 250m1H2O 中配制成工作液。 2.2.2.2 做胶，银染 1) 50ml 10%PAGE 胶，300ul10%APS, 50u1TEMED，依次混合，充分摇匀。2)用清水将玻璃板反复冲洗干净，干燥。将玻璃板泡入硅化剂中半小时，在 通风橱中晾干，涂上反硅化剂。待干燥后，使用垫片进行玻璃板的组装，灌胶。 注意灌胶过程中小能留有气泡，一旦有气泡产生就用小刀轻轻将其挤破。最后 垂直插入梳子，待胶凝固。 3)把玻璃板固定在垂直板电泳槽上
9、，在上下槽分别加入 1 TBE Buffer。将梳 子轻轻拔出。用移液器反复吹打加样孔，以清除加样孔中沉淀的丙烯酰氨和尿 素。l0m1PCR 产物中加入 7ml 溴酚蓝混匀，取 1ul 混合液加入凝胶梳孔中。 4) 220V 电压电泳，直到溴酚蓝中的二甲苯青电泳到凝胶底部，取凝胶。 5)银染: 固定:取合适的塑料盘，倒入 2000ml 新鲜配制的银染固定液，放入凝胶，在 摇床上轻摇 10min 左右:用蒸馏水冲洗胶板 2 次; 染色:加入 AgNO3工作液，轻摇 8-10min: 最好不要超过 10min。用蒸馏水冲 洗胶板 2 次; 显色:把胶板快速转移到 2000ml 预冷的显色液中并轻摇，直至出现清晰的带 纹；用蒸馏水冲洗胶板 2 次:稍稍晾干，拍照。
