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1、转病毒移动蛋白及复制酶基因烟草的协生和重组风险分析牛颜冰，李桂新，温瑞，周雪平（浙江大学生物技术研究所， 杭州310029）摘要：对转化番茄花叶病毒 （ToMV） 、 烟草花叶病毒 （TMV）移动蛋白 （MP） 基因和黄瓜花叶病毒 P1 株系（CMV-P1） 部分复制酶基因的 3 种转基因烟草， 分别接种马铃薯 X 病毒（PVX） 、 马铃薯 Y 病毒（PVY） 、 CMV RB株系（CMV-RB） 和 TMV。症状观察和 ELISA 测定发现， 各病毒在转基因烟草和非转基因烟草上的症状及病毒浓度没有显著差异， 表明这些病毒在转基因烟草上没有协生作用发生。对转化 ToMV MP 基因和转化 C
2、MV-P1 部分复制酶基因的转基因烟草， 分别接种 TMV 和 CMV-RB， 定期进行生物学、 ELISA 和免疫捕获反转录 PCR （IC-RT-PCR） 检测， 在 16 个月的连续测定中未发现病毒重组现象。关链词：烟草； 转基因植物；病毒；协生；重组Risk Assessment of Synergism and Recombination on the Transgenic Tobacco PIants Containing ViraI Movement Protein and RepIicase GenesNIU Yan-bing，LI Gui-xin，WEN Rui，ZHOU X
3、ue-ping（Institute of Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310029）Abstract：The transgenic tobacco plants transformed with movement protein genes of tomato mosaic virus （ToMV）and tobacco mosaic virus（TMV）and partial replicase gene of cucumber mosaic virus P1 isolate（CMV-P1） ，respectively，were in
4、oculated with PVX，PVY，TMV and CMV isolate RB，separately. Symptomobservation showed that there were no differences in symptom between transgenic and non-transgenic tobaccos.ELISA also illustrated that the virus concentrations in transgenic plants were similar to those in non-transgenictobaccos，indica
5、ting that no synergism is found in these plants. The transgenic tobacco plants with movementprotein gene of ToMV or partial replicase gene of CMV-P1 were inoculated with TMV and CMV-RB，respec- tively. The local or systemic infected leaves were then used for elucidation of the possible virus recombin
6、ation intransgenic plants with biological infectivity test，ELISA and immuno-capture RT-PCR. Within 16 months，norecombination has been found between transformed genes and inoculated virus genomes.Key words：Tobacco；Transgenic plants；Virus sequence；Synergism；Recombination收稿日期： 2002-06-25基金项目： 国家自然科学基金资
7、助项目 （39870499） 和教育部高等学校优秀青年教学科研奖励基金资助项目作者简介： 牛颜冰 （1968-） ， 女， 山西长治人， 博士研究生， 主要从事植物病理学和作物抗病性研究。周雪平为通讯作者， Tel： 0571-86882197；E-mail： 自 1986 年 Powell Abel 等首先将烟草花叶病毒（TMV） 外壳蛋白 （CP） 基因导入烟草获得抗 TMV的转基因烟草以来1， 利用病毒来源的基因获得抗性转基因植物已成为植物抗病毒基因工程的重要途径。目前， 通过转化病毒的 CP、 复制酶以及缺陷型移动蛋白 （MP） 等基因已获得了多种抗病毒转基因植物， 进入大田试验的转基
8、因植物数目也日见增加。在国内， 已有多家单位利用病毒来源的基因相继培中国农业科学2003， 36 （4） ： 393 - 397 Scientia Agricultura Sinica育出抗病毒的转基因烟草、 甜椒、 马铃薯、 油菜、 小麦等， 其中抗 CMV 的转基因番茄和甜椒已被批准商品化生产。随着抗病毒转基因植物的大量出现， 人们开始担忧利用这类转基因植物是否会造成预想不到的风险， 如转入的病毒基因是否会与入侵的野生型病毒发生重组而产生毒性更强的新病毒； 转病毒基因植物是否会加重野生型病毒侵染的症状等2。转病毒基因植物的风险主要包括基因重组 （re-combination） 、 协生作用
9、 （synergism）和衣壳转移 （transcapsidation）3 个方面。所有这些风险都涉及到转入的病毒基因与入侵转基因植物的病毒之间的相互作用。笔者所在的实验室， 在克隆和测定了TMV 和 ToMV 全序列 （AJ011933 和 AJ132845） 及CMV 复制酶基因序列 （AJ319665 和 AJ319666） 的 基础上， 已将 TMV 和 ToMV 的 MP 基因及 CMV的部分复制酶基因分别导入烟草， 并利用转复制酶基因和 MP 基因烟草开展了转病毒基因植物协生作用及重组风险研究， 现将结果报道如下。1材料与方法1.1毒源PVX 、 PVY 、 TMV 分离物 B （
10、TMV-B） 、 CMV 分离物 P1 （CMV-P1） 和 RB （CMV-RB） 均由本所分离， 并保存繁殖于三生烟 （ Nicotiana tabacum Sam-sun nn） 上。1.2供试植物 转化 TMV MP 基因的烟草 （N . tabacum） 株系T19、转化 ToMV MP 基因的烟草株系 O15 和转化CMV-P1 部分复制酶基因的烟草株系 C-P1-RP 均 由本实验室提供； 非转基因的普通烟 （ N . tab-acum） 、 三生烟 （ N . tabacum Samsum nn） 、 心叶烟 （N . glutinosa） 和蚕豆 （ Vicia fata）
11、由本实验室保存。1.3抗血清TMV、 ToMV 及 CMV 单抗和多抗血清由本实 验室制备。PVX 、 PVY 多抗及单抗血清由德国联邦作物育种中心抗性研究及病害诊断研究所提供。1.4转基因烟草的扩繁及接种 将转基因烟草 O15、 T19 和 C-P1-RP 在 MSs 培养基中扩繁， 将其中已成芽的部分切下移至含 Km100gml- 1生根培养基 MSr 上培养。有 5 8 条 主根后， 将无菌苗在 25开盖培养锻炼 3 d， 移栽到土壤中， 待烟草长至 4 5 叶期时进行接种。将扩繁的 T19、 O15、 及 C-P1-RP 分别接种 PVX、 PVY、TMV、 CMV-RB， 并以非转基
12、因的普通烟为对照。1.5ELISA 测定 采用青玲等3报道的三抗体夹心 ELISA （TAS-ELISA） 。1.6免疫捕获反转录 PCR （IC-RT-PCR） 根据测定的 ToMV 和 TMV 的 MP 基因序列（AJ006991 和 AJ011934） 及 CMV P1 和 CMV RB的复制酶基因 （AJ319665 和 AJ319666） 合成 3 对特异性引物， 其序列见表 1。表 1PCR扩增所用引物序列Table 1Sequences of primer pairs for PCR amplification名称 Name方向 Orientation序列 SequenceToM
13、V MP-F 正 Forward5-CCGGATCCATGGCTCTAGTTGTTAAAG-3ToMV MP-R 反 Reverse5-TCCCCGGGTTAATACGAATCAGAATCCGCG -3TMV MP-F正 Forward5-CCGGATCCATGGCTCTAGTTGTTAAAG-3TMV MP-R反 Reverse5-TCCCCGGGTTAAAACGAATCCGATTCGGCG -3CMV RP-F正 Forward5-ATAACTAAGTGGTGGTGTG-3CMV RP-R反 Reverse5-CAGACTTCTTGTATTTCAA-3利用设计的特异性引物， 采用 IC-R
14、T-PCR 方法扩增病毒基因， 参阅蒋军喜等4的方法。2结果与分析2.1转病毒基因植物的协生作用分析2.1.1症状观察病毒接种转基因普通烟后， 对接 种的植株定期进行症状观察。结果表明， 接种PVX、 PVY、 TMV 和 CMV 后 7 10 d， 各病毒在转 化 ToMV MP 基因的烟草 O15、 转化 TMV MP 基因的烟草 T19 和转化 CMV-P1 部分复制酶基因的烟草 C-P1-RP 上均产生明显症状， 与非转基因普通烟对照相比在症状上没有明显的差异， 病毒接种 14 d后在转化 ToMV MP 基因的普通烟 O15 及非转基因普通烟上的症状比较见表 2。2.1.2病毒浓度测
15、定接种转基因烟1周后， 每隔7 d 取转基因烟草和非转基因烟草的系统病叶， 用TAS-ELISA 法测定病毒含量， 结果见图 1 和图 2。 从图 1 可以看出， PVX、 PVY、 TMV 和 CMV 侵染转TMV 或 ToMV MP 基因的转基因烟草后病毒积累 量与非转基因对照的十分相似。从图 2 可知， 各病毒在转 CMV-P1 部分复制酶基因烟草上的积累量与对照也基本一致。2.2转病毒基因植物的重组风险分析2.2.1转 CMV-P1 部分复制酶基因烟草的重组风 险分析在研究CMV致病分子机理时， 陶小荣等通493中国农业科学36 卷表 2PVX、 PVY、 TMV 和 CMV 在转 T
16、oMV MP 基因及非转基因普通烟上的症状比较Table 2Symptoms on transgenic N . tabacum with ToMV MP gene and non-transformed tobacco plants inoculated with PVX，PVY，TMV and CMV病毒 Virus症状Symptoms转基因普通烟Transgenic N . tabacum对照ControlPVX系统斑驳、 花叶Systemic mottle，mosaic系统斑驳、 花叶Systemic mottle，mosaicPVY系统斑驳、 花叶Systemic mottle，mosaic系统斑驳、 花叶Systemic mottle，mosaicTMV系统花叶， 叶片皱缩， 植株矮化Systemic mosaic， leaf crinkle， stunt系统花叶， 叶片皱缩， 植株矮化Systemic mosaic， leaf crinkle， stuntCMV系统花叶， 叶片畸形，
