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1、高效液相色谱 1. 概述 2. 基本原理 3. 各类 4. 固定相 5. 流动相 6. 仪器 7. 定性、定量分析第一节 概述优 缺经典 用范围广 效率低效、高速， 300多万化合物中高灵敏度、自动化 仅 20%能用 由经典液相色谱 高效填料 ： 5 m 10 m 高效 （ 经典 m）2、 高压泵输液 ： 高压3、 高灵敏度的检测器 ： 仪器化1、 适用范围广2、高效3、高速4、高灵敏度（主要用 5 10、 流动相选择范围宽6、柱可以反复使用（可用 1、流动组分易收集8、 安全第二节 基本原理一、范氏方程：1、 柱内展宽 ：H=A+B/ +纵向扩散 在前述气相 =205倍在 故高效液相色谱的范
2、氏方程为：H = A + +涡流扩散项： A=2 传质阻抗项引起板高： C= 以 a、 引起部分： 忽略常数与颗粒内空隙体积分数及容量因子有关 。s 组分在固定相中扩散系数 。固定相的粒度 21 b、 由流动相引起部分： , ,（ 静态流动相物质阻抗项 ）流动相的物质阻抗系数 ， 与填充物质结构有关 =A+ ） ) ， H ， n(2)流动相粘度降低 ， ， H ， n(3) 要使 ， H 填充要均匀 。21 121 2、柱外展宽：进样器联结管边等死体积越小越好 。 20体积约 1 H=A+在 直线关系 ） ， H ， n ，为了兼顾柱效和分析速度 ， 一般采用较低流速 ， 多用 1ml/二、
3、分离度及影响因素：又可：讨论如何由 n、 、 k 来改变 K ， R ， 8的碱应用离子对色谱 。 抑制剂弱酸 （ 、 弱碱 （ 2O） 或缓冲液3、 1)凡在反向色谱中的影响因素 ， 此处同样影响 。(2) k,t R(以离子形式为主 ， 流动相中多 )弱碱与上恰相反 。 之 ， 8， 超出将会腐蚀仪器 ， 流路系统 。4、用途：（ 1） 有机弱酸或弱碱与两性化合物的分离 。（ 2）有机弱酸或弱碱与分子型化合物的分离。注意：对于 第四节 固定相一 、 L 1）表孔硅胶：（薄壳玻球 点：易装柱，但柱效不高，柱容量小（ 10005000）（ 2） 无定形全多孔硅胶： 510 效高，柱容量大，但要
4、匀浆装柱。价格便宜（ 80000100000）（ 3） 球形全多孔硅胶： 310 具有 具涡流扩散项小及渗透性好等特点。（ 4）堆积硅珠： 凝胶剂聚结而成。 35 质阻抗小，柱容量大（ 80000）表孔硅胶(定形全多孔硅胶硅胶 （ 形全多孔硅胶（ 积硅珠特点易装柱 ， 柱效不高 ， 柱容量小 （ n 10005000）柱效高 ， 柱容量大 ， 但要匀浆装柱 （ n 8000100000）具 具涡流扩散小， 渗透性好传质阻抗小 ， 柱容量大（ n 800000）特点表孔硅胶 (易装柱，柱效不高，柱容量小（ 10005000）无定形全多孔硅胶（ 柱效高，柱容量大，价廉，但硅胶 要匀浆 8000形全
5、多孔硅胶（ 具 涡流扩散小，渗透性好堆积硅珠 传质阻抗小，柱容量大（ 800000）2、 高分子多孔小球 ： 柱效低 103）又称有机胶：苯乙烯与二乙烯苯交联而成 。用途：分离芳烃 、 杂环 、 甾体 、 生物碱 二 、 L 体 +固定液（ 一 ） 机械涂渍 （ 现高效中基本淘汰 ）（二）化学键合相：采用化学反应的方法将固定液结合在担体上。具有吸附与分配双重作用。优点：不流失，稳定（ 液中不变质），热稳定性好，且能用于梯度洗脱。非极性键合相：键合非极性基团： 十八烷基 ）化学键合相 中等极性键合相：醚基键合相 （ 正反应用流动相极性反应 ）极性键合相：键合极性基团 （ 氨基 、 氯基 ）1、
6、非极性键合相 ：键合相表面基团为非极性基团 。常用： 十八烷基键合相 ） 载体：全多孔 堆积硅球 ， 作为 国产如： 5， 10 m） ， 5， 10 m） 表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例为表面覆盖度 。 其覆盖度的大小 ， 决定键合相是分配还是吸附占主导作用 。 键合基团键长： ， 载样量 ， k2、 中等极性键合相 ： 醚基键合相 （ 正 、 反色谱由流动相极性而定 ）3、 极性键合相 ：键合极性基团 （ 氨基 、 氰基 ）国产品： 5， 10 m）(三 )离子交换剂经典液相色谱的交换树脂 ， 不耐压 ， 不适用 ， 此处用离子键合相 。载体：薄壳型或全多孔微粒
7、硅胶 。离子交换基团： 强酸型强碱型注意：在 的流动相时使用，且要控制一定的离子强度。当色谱条件一定时，柱交换容量大，保留时间长。当色谱条件一定时，柱交换容量大，保留时间长。（四）凝胶：（空间排斥色谱）具有一定孔径的多孔性凝胶。第五节 流动相 在 剂不同，与分子间作用力不同，有可能使组分的 变溶剂的极性，对组分的洗脱能力改变， 验时可适当配比，以至得到较适宜的 R。 对流动相的要求： 1、 不与固定相反应 2、 对样品的溶解度适当 3、 与检测器匹配 4、 粘度小 优化及选择自学 （ 不要求 ） 。)1)(1(4 22第六节 仪器输液泵 进样器 色谱柱 检测器 记录一 、 输液泵： 往复泵二
8、、 色谱柱与进样器 ：1、 进样器： 早期用隔膜进样阀 ， 带压进样 ， 操作困难 ，进样器易反弹出而损坏 。六通阀：优势：进样量准确 ，重现性好 ，可带压进样 。柱管和固定相组成 。柱管 ：不锈钢管 20常量柱 11020常微量柱装柱 是一项技巧性很强的技术，它直接影响柱效。当填料 20 m， 较易装，干法，轻叩。粒度 20 m， 匀浆装柱。（先将填料用等密度的有机溶剂匀浆，再高压装柱。无论装柱还是买柱，要进行柱效检查。测度条件根据柱类型不同而选用不同的检测。测出各组分的 W， 求出 70%三 、 检测器 荧光 多用 15%示差分析电化学蒸发光散射检测器（ 一 ） 紫外检测器 ：优：灵敏度高
9、，精密度、线性范围好，可用于梯度洗脱。缺： 样品组分应吸收紫外光 要考虑溶剂的极限波长1、固定波长型：光源： 254类检测器光源强度大，灵敏度高，检测限可达 1 10是一种简便实用的检测器。2、可变波长检测器可选择 类似于可见 紫外分光光度计），将波长调在 最大的 增加灵敏度。（有些配置较好的还可同时扫出紫外光谱），现多数 、 光电二极管陈列检测器：通过吸收池的光经光栅分光 200分光的光进入由 500个单元组成的光电二极管陈列上。可同时测每隔 1此 200380及 381699的谱线瞬间（约 60就可测出。信号经处理后记录仪打出三维空间图，或是平均吸光度色谱图。优：可鉴别重叠峰，确认峰纯度，
10、比较各峰化学结构，并可从几个通道同时进行峰面积计算，提供最佳定量标准。（ 二 ） 其它检测器1、 荧光检测器：样品应有荧光 ， 灵敏度比紫外更高 。 检测限 1 10示差检测器：利用组分与流动相的折射率之差，类似气相热导、利用组分与载气热导率不同，进行检测。缺：对多数物质检测限较低。环境、温度对其均有影响。3、 电化学检测器：利用组分氧化还原反应，产生电流或电压变化进行检测。对还原性物质检测限 1 10缺：不能测不能氧化还原的物质。第七节 定性、定量分析一 、 定性分析：1、 12 相对保留值 =2、化学鉴定 ：对 专属性化学反应对收集的分离物质组分进行定性。3、联机技术 ： 利叶转换红外光谱
11、2121二 、 定量分析：与气相色谱同 。1、 外标法：以试样的标准品作对照物质 ， 相对比较求含量 。（ 1） 工作曲线法：用待测组分的标准品配制一系列浓度不同的标准溶液 (Ci)s， 准确进样 ， 测量峰面积 (Ai)hi)s，与 (Ci) 利用此曲线或它的回归方程 ， 计算样品溶液的含量 。（ 2） 外标一点法： （ 与气相同 ）mi=()(2、 内标法：内标选择同气相 。（ 1） 工作曲线法：在待标准溶液系列中 ， 同体积加入相同量的内标物 、 进样 ， 分别测出标准物与内标物的 A或 h， 以s(Ci)（ 2） 内标一点法：在药物分析中 ， 校正因子常常不知 ， 则先配已知浓度标准品
12、 ， 加入一定内标 ， 再将内标按同量加入同体积样品中 ， 分别进样 。（ 样品 =样品样品样品 %)()/()/(、 校正因子法：第一步：精称被测组分的标准品 加一定精称 二者峰面积比求出 f； 再用待测组分的峰面积与样正因子计算含量。令 第二步：称一定量样品，加入与测校正因子时相同量的内标物，配液、进样，测出 s。式中 m 称样量注：用校正因子法时 ， 实验条件必须稳定 、 波长应重现性好 。%1 0 0 fA 1、 了解 2、 掌握范氏方程与气相中的区别。3、 掌握分离度影响因素。4、 掌握各色谱的原理（ ls,正，反 ），流出顺序5、 固定液与流动相的选择6、 仪器：重点：泵、六通阀、检测器7、 定性、定量计算：8、 色谱（气、液、）两个理论作业： 1、 2
