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1、1产糖化酶根霉的分离以及酶学性质的初步研究产糖化酶根霉的分离以及酶学性质的初步研究*孔维锐，郭福宗，周胜，寸跃芳，唐湘华*（云南师范大学生命科学学院，云南 昆明 650500）【摘要摘要】：从五粮液酒厂周边采集而来的土样中分离出六株产糖化酶且酶活较高的菌株，选取酶活最高的一株 K-1为出发菌，进行发酵实验，并测得糖化酶在 50-55酶活较高，最适作用温度为 55。且糖化酶在 pH 值 5.5-6 之间酶活力较高。酶对玉米粉、小麦粉、木薯粉、苦荞粉、黄豆粉有较强的液化能力，其中对玉米粉的糖化能力最强。在酶的动力学实验中测得Km=1.446mg/ml，Vm=0.269mg/ml.min 。关键词：
2、关键词：根霉;糖化酶;酶学性质Study in separation of Rhizopus and glucoamylase charactersKong Weirui, Guo Fuzong, Zhou Sheng, Cun Yuefang, TangXianghua*(Yunnan Normal University, School of life science, Kunming 650500, China)Abstract: 6 strains that were isolated from soil aroung Wu liang ye brewery could produce
3、glucoamylase and have higher enzyme activity. The one which has the highest acitvity was selected to be the starting bacteria to ferment. The enzyme acitvity of glucoamylase is higher between 50 to 55 and the optimal temperature is 55. The enzyme activity of glucoamylase is higher between pH 5.5-6.
4、the enzyme can liquefy corn flour, wheat flour, tapioca starch, buckwheat powder, soybean meal strongly. And the enzyme can saccharize corn flour better. The kinetics experiment of the enzyme showed us some data: Km = 1.446 mg/ml, Vm = 0.269 mg/ml * min. Key words: Rhizopus; Glucoamylase; glucoamyla
5、se characters 根霉细胞中不仅含有丰富的糖化酶，还含有一定的酒化酶系，可以边糖化 边酒化同时含有能产生曲酒香味前体物质的酶系1。而且根霉比曲霉更具有糖 化力高，适应性强、繁殖速度快等特点。生长速度快、对温度、湿度、营养的 适应范围很广。 糖化酶是淀粉糖化酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3）的简称，又称为-淀粉酶 （- amylase） ，糖化酶能从淀粉非还原性末端依次切下一个葡萄糖单位，将淀 粉水解为葡萄糖。因此，它被广泛地应用于酒精、白酒酿造、抗生素、氨基酸、*基金项目：2011 年“云南省大学生创新性实验计划项目-宜宾五粮液酒厂周边根霉产糖 化酶能力筛选及其固体
6、发酵条件优化” ，项目编号：KXX2011-12-284。2作者简介：孔维锐， （1987-） ，男，云南曲靖人，在读本科，生物技术专业。 *通讯作者：唐湘华，讲师，生物工程专业，云南师范大学呈贡校区生科院2005#，邮编： 650500，E-mail:.有机酸、甘油、纺织、日化等工生物业中2，是我国最大的工业酶制剂产品3，多年来对糖化酶的研究主要集中于提高菌株的产酶能力3-5改善发酵条件6。本实验的目的就是筛选复合酶系协同作用强的菌种，供葡萄糖生产或酿酒工业应用。1 材料与方法材料与方法1.1 材料材料1.1.1 土样来自：宜宾五粮液酒厂周边土壤1.1.2 主要的药品与试剂：无菌水、3,5-
7、二硝基水杨酸(DNS)7、2%可溶性淀粉溶液，pH=4.6 乙酸-乙酸钠溶液8。生长因子： FeSO4(0.01)、KCl(0.05)、MgSO 4(0.05)、(NH4)2SO4、NH4C1、KNO3、NaNO3、NH4NO3。1.1.3 部分仪器及设备：高速冷冻离心机（飞鸽牌） ， UV-2000 紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司） ，立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂） ，超净工作台等。1.1.4 培养基：分离培养基：可溶性淀粉 0.5g，蛋白胨 0.5g，酵母膏0.5g，KH2PO4 0.05g，MgSO47H2O0.01g，CaCl22H2O0.05g，琼脂 2.5g
8、，pH 为5.0 。0.1Mpa，121条件下灭菌 30min，冷却至约 50，倒 56 块平板/100mL，冷却备用。液体发酵培养基：可溶性淀粉 2.0g，蛋白胨 0.5g，酵母膏 0.5g，KH2PO4 0.05g，MgSO47H2O 0.01g，(NH4) 2SO4 0.1g，CaCl22H2O 0.05g，水100ml，pH 为 6.0。 1.2 方法方法1.2.1 菌株分离及培养方法称取 5g 土样，在研钵中研成粉末状，放入盛有 45ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中。振摇 10 分钟，使样本与水充分混合。振荡混匀后静置，取上清液1ml 与 9ml 无菌水试管中，以此类推，制成 10
9、-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等各种稀释度的溶液，吸取各种稀释度溶 0.1ml 于分离培养基涂布均匀，置于30OC 培养箱中培养 48h。观察分离培养基平板长出的菌落周围有无透明水解圈，取水解圈较大者接种于筛选平板上划线分离离至纯种，斜面保存9。31.2.2 糖化酶活力的测定葡萄糖标准曲线制作：分别在 25ml 的具塞试管中加入 0ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4 ml、1.6 ml 的 1mg/ml 的葡萄糖标准液, 加蒸馏水补至 2ml,分别再加入 3ml 的 DNS 试剂，置沸水浴中煮沸 5 分钟，然
10、后取出流水冷却，加蒸馏水 10ml 振荡摇匀，以无葡萄糖标准液管作为空白调零点，在 540nm 波长下比色测定。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线10。糖化酶酶活力的定义： 1 毫升酶液在 55，pH6.0 的条件下，每分钟水解可溶性淀粉产生 1umol 葡萄糖的酶量为 1 个酶活力单位（U） （国标法糖化酶活力单位定义） 。酶活力单位（U/ml）= K(ODA + ODB )/2 + bN103 /10/0.2/180.2式中：ODAA 管的吸收光度值； 103mg 转换为 ug；ODBB 管的吸收光度值； 180.2葡萄糖的摩尔质量；N酶液的稀释倍数； 10表示酶反应时
11、间为 10min；K：标准曲线斜率。酶液的制备：取液体发酵液 1ml 于装有 9ml 蒸馏水的试管中并震荡混匀，然后倒入离心管中离心，取上清液备用。酶活测定方法：取 2%淀粉悬浮液 1.8ml 于 25ml 的试管中，55oC 预热10min，加入 0.2ml 酶液，于 55oC 条件下反应 10min 后，加入 3mlDNS 终止反应，摇匀，置沸水浴中煮沸 5 分钟，取出后流水冷却，加蒸馏水至 15ml 振荡摇匀，以不加酶管作为空白调零点，在 540nm 波长下比色测定。1.2.3 酶学性质的的初步研究1.2.3.1 温度对酶活的影响：分别在 37oC、45oC、50oC、55oC、60oC
12、、65oC 条件下酶反应 10min 测定酶活力。1.2.3.2 pH 对酶活的影响：配制 pH 为 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 的乙酸-乙酸钠溶液缓冲液，用不同 pH 值的缓冲液配制 2%的淀粉底物，测定各不同pH 条件下的酶活。1.2.4 酶的动力学研究4分别配制 0.3125mg/ml、0.625mg/ml 、1.25mg/ml 、2.5mg/ml、 5mg/ml 、10mg/ml 可溶性淀粉溶液，各取 1.8ml 在 55 oC 下预热加入 0.2ml 酶液，55 oC下反应 5 分钟后测还原糖含量，计算反应速度，根据米氏方程采用最常用的双倒数作图法作图，然
13、后以 1/S对 1/v 作图，可得到一条直线。这条直线在横轴上的截距为-1/Km，在纵轴上的截距为 1/Vm，由此即可求得 Km和 Vm。 1.2.5 糖化酶对酿酒原料液化能力的测定分别称取通过 0.1-0.125mm 孔径筛子筛出来的 5g 玉米粉、小麦粉、木薯粉、苦荞粉、黄豆粉末于装有 95ml 水的 200ml 烧杯中，在酒精灯上加热煮沸至浆糊状，55oC 预热 10min，然后向每一个样品液烧杯中取出 0.2ml 于试管中待用，作为比色时的对照。然后向各烧杯中加入 1g 酶粉并计时,且在 55oC 下不断搅拌,反应每隔 10min 用移液枪各取 0.2ml 上清液于 25ml 的试管中
14、补加蒸馏水1.8ml，分别再加入 3ml 的 DNS 试剂，置沸水浴中煮沸 5 分钟，然后取出流水冷却，加蒸馏水 10ml 振荡摇匀，在 540nm 波长下比色测定，计算还原糖含量。2 结果与分析结果与分析2.1 葡萄糖标准曲线如图 1 所示：得回归直线方程y=kx+0.026，k=0.941，R2=0.9980.99，该标准曲线相关性很好。式中 Y 表示表示测定的吸光度（OD）值，X 表示还原糖的浓度,0.026 表示补偿参数。图 1 标准曲线 图 2 菌株筛选 52.2 菌株筛选结果将土样进行稀释涂布分离，在以淀粉为唯一碳源的分离培养基上 30oC 下倒置培养 1 到 2 天，筛选到 6
15、株酶活较高的菌株，测得酶活力如图 2，选取酶活最高的菌株 K1 作为实验菌株。菌株在分离培养基上生长快，菌落近似圆形，表面为褐黑色，菌丝白 色，菌丝无隔膜、有分枝和假根 。初步鉴定为根霉 。菌落、菌丝体、孢子如图 3、4、5 所示。图 3 菌落 图 4 假根 图 5 孢子2.3 酶学性质的初步研究 2.3.1 温度对酶活的影响在不同温度下测定酶活力，结果如图6 所示，由图可知酶作用的最适温度为 55，而且随着温度的升高酶活的变化较大 。2.3.2 pH 对酶活的影响不同 pH 下酶活，结果如图 7 所示，可见酶在 pH 值 5.5-6 之间酶活较高，最适 pH 为 5.5。6图 6 图 72.6 该酶动力学研究学实验结果如图 8 所示，以 1/S对 1/v 作图得图 9，所得方程为 y=5.372x+3.716，由曲线与 X 轴的焦点-1/ Km 算的 Km=1.446mg/ml，曲线与 Y 轴焦点纵坐标 1/ Vm 计算得到 Vm=0.269mg/ml*min 。图 8 图 92.7 糖化酶对酿酒原料液化能力的测定的结果分别如图 10 所示，该酶对几种原料具有糖化作用较强。其中对玉米粉、高粱粉、小麦粉的液化能力比小米粉、苦荞粉、木薯粉的强。云南玉米、高粱生产产量高，原料来
