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1、一、一、 脂肪干细胞（脂肪干细胞（ASCsASCs）的提取及鉴定）的提取及鉴定1 1、实验技术及原理：、实验技术及原理： 运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后 ACSs 的表型会发生改变，主 要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管 细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除 ASCs，还包括血细胞、成纤维 细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴 壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的 ASCs 可再很长时间内保持摸分化状态）。取 C57BL6 WT 小鼠 2 只，常规麻醉 消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊
2、状，PBS 液冲洗去麻药及血液，0.075%II 型 胶原酶消化（37，30 分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离 心（1200g,10 分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS 的 DMEM 重悬细胞沉 淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过 200 目铜网，得到单个 核细胞。镜下计数，按 10个细胞/ml 种植在培养瓶中，375%CO2孵箱培养， 24 小时后第一次换液，以后 3 天换液一次，80%融合后 0.25% Trypsin,0.02%EDTA 消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式 细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44
3、）的鉴定。2 2、实验用品：、实验用品： 2.1材料：C57BL6 WT 小鼠 2.2 试剂：PBS 液，0.075%II 型胶原酶消化，10%FBS，低糖 DMEM 2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离 心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200 目铜网过滤器，低糖 DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3 3、细胞培养的方法与步骤：、细胞培养的方法与步骤： 3.1 无菌操作的要领和要求。 3.2 细胞原代培养： 3.2.1 操作步骤 a培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备 工作。 b. 取材：取
4、 C57BL6 WT 小鼠 2 只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪 碎至糊状，PBS 液冲洗去麻药及血液。 c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II 型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml 或 200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于 37 水浴或恒温箱中 30 分钟），每隔 5-10min 振荡一次。30min 后，生理盐水终止 胶原酶的消化。 d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min 10 分 钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS 的 DMEM 重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯 化氨溶解剩余红细胞，将
5、收集的细胞悬液经 200 目铜网过滤，1200r/min 离心 10 分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根 据计数结果调整细胞浓度为 10个细胞/ml。e接种培养：每 10cm2 的培养瓶接种 1ml 的细胞悬液，再添加 4ml 的培养 液，盖紧瓶塞。标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情 况后，置于 375%CO2孵箱培养。 3.2.2 观察 每天对接种培养的细胞做常规性检查。观察的主要内容：污染与否、细胞 生长状态和 pH（培养液颜色变化）等情况。如发现培养液变为柠檬黄色有浑浊， 表明已被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。如培养液颜色变为紫
6、色， 可能系培养瓶有裂口或瓶塞漏气，CO2 逸出或由于细胞生长不良有大量死亡。 如培养液为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。 在没有发生污染，接种 24h 后，可见到许多细胞贴壁（由圆形悬浮状态的 细胞延展成短梭状），24 小时后第一次换液，以后 3 天换液一次。培养 3-4 天 时，细胞生长繁殖，细胞数量增加，并可见细胞形成孤立小片（细胞岛），逐 渐扩展，细胞透明，颗粒啥，界线清晰。7-10 天细胞已基本铺满瓶壁形成致密 单层，（80%融合后）可进行传代培养。 3.3 细胞传代培养 3.3.1 操作步骤 a取一瓶脂肪干细胞在倒置相差显微镜下观察，培养细胞如长成致密的单 层，即可进行传代。 b
7、将培养瓶带人超净工作台，倒去细胞培养液，吸取 2ml-3ml PBS 加入培 养瓶中，轻轻振荡后倾去，可重复进行一次。 c加入 5-8 滴 0.25% Trypsin,0.02%EDTA，转动培养瓶，使其湿润整个细 胞层，置于室温下笑话 2-3min。翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层 薄膜上出现针孔大小空隙时即可倒去消化液。如见消化程度不够时可再延长消 化 1-2min。如见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能倒去消化液而直接进 行下一步操作。 d加入 3ml 培养液于培养瓶中终止消化。吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的 细胞层，直至瓶壁上的细胞全被冲下，再轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。取
8、样计数，调整细胞浓度为 10个细胞/ml。吸取 1ml 细胞悬液加到另一培养瓶中， 原瓶留下 1ml 细胞悬液，弃去多余悬液（可分别提取 1ml 接种分配到多个培养 瓶中），并向每瓶中加 4ml 培养液。盖好瓶盖，标上名称、组号和日期，在倒 置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于 375%CO2孵箱培养。 3.3.2 观察 细胞传代后，每天对细胞进行观察，注意污染与否、细胞贴壁和生长状态 等情况 消化传代。此过程中所做处理同原代培养。注意观察细胞五个时期的特点 （游离期、吸附期、繁殖期、维持期、衰退期）。 细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，这时可进行再次传代培养。4 4 细胞镜下作形态学观察及取
9、第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞 免疫表型（免疫表型（CD29/CD44CD29/CD44）的鉴定）的鉴定 4.1 在细胞镜下作形态学观察，与正常形态比较（原代培养后，传代 2-3 次，ACSs 呈现单层，大而扁的细胞形态，其直径在 25-30um，待细胞达到汇合 时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞） 4.2 细胞周期分析分别取生长融合达 30%-40%和 90%以上的第三代细胞，以 4C 预冷的 70% 冰乙醇固定，4C 放置 24 小时；用 PBS 洗涤 2 次；加入 RNA 酶 10ug 和碘化丙 啶（PI）0.3
10、ml 重悬细胞（4C，30 分钟）。用流式细胞仪以 FL2 红色荧光条 件检测。应用 Modfit LT 2.0 软件分析细胞周期。 取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴 定。 4.2 细胞表面分子免疫标记的鉴定 a.方法：直接免疫荧光法 b试剂及材料：单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE,及同型对照抗体；细胞 洗液：含 2%BSA、0.1%NaN3 的 PBS；固定液：1%多聚甲醛 PBS 液（pH7.2）； 4、流式细胞仪。 c操作方法： 每个样品取 2 只，分别标记同型抗体作为阴性对照、待测，分别加入 106 个/100ul 待测细胞。对同型对
11、照管中加入荧光标记单克隆抗体 CD29 、CD44 对照抗体作为阴性对照，待测管加入荧光标记单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE 为实验管，各 20ul，混匀。置于于室温避光孵育 30 分钟，加入 2ml 的 PBS，1200r/min 离心 10min，弃上清，控干，加入固定液 0.5ml（染色缓冲剂） 。先测同型对照，再测实验管。软件采集数据，分析阳性细胞比例。二、携带二、携带 PTNPTN 表达基因的脂肪干细胞的获取及鉴定表达基因的脂肪干细胞的获取及鉴定 1、实验技术及原理：运用基因转染技术，将带 PTN 基因的反转录病毒载体 转染到脂肪干细胞，抗生素 G418 和流式细胞仪筛选，
12、得到 PTN 高表达的脂肪干 细胞。 2、具体操作： 2.1 材料及试剂： 2.2 脂肪干细胞的准备：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何， 将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日， 必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培 养器皿的 60%为宜，转染当日，在转染前 4 小时换一将近新鲜培养液。对于悬 浮细胞，也需在转染前 4 小时换一次新鲜培养液。 2.3 将带 PTN 基因的反转录病毒载体转染到脂肪干细胞，带有 PTN 基因混 合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇 培养皿，以确保均匀分布和避免局部高
13、浓度。 2.4 用抗生素 G418 和流式细胞仪筛选，得到 PTN 高表达的脂肪干细胞 G418 筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至 1000cell/ml，每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板，将每孔中的 G418 浓度稀释至 0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml 等2 个级别, 培养 10-14 天， 以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般 400-800 左右，筛选时比该浓度再高一 个级别，维持使用筛选浓度的一半 流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组 pcDNA3单细胞悬 液70%酒精固定裂解细胞核糖核酸酶消化碘化丙啶染色上机分析 G1 期和 G2/M、S 期比例。
