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1、第四章第四章 生物化学与分子生物学技术实践生物化学与分子生物学技术实践 4.14.1 生物成分的分离与测定技术（蛋白质的分离与纯化）生物成分的分离与测定技术（蛋白质的分离与纯化） 探究目的：探究目的：1、体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法2、了解电泳法分离生物大分子的基本原理 探究预习：探究预习：实验操作程序 (1)样品处理 红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化； 血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来； 分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。 (2)粗分离 原理：透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在
2、袋内，透析可以除去样品中分子质量较小的杂质。过程：取 1 mL 的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300 mL 的物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸缓冲液中(pH 为 7.0)，透析 12 h。 目的：图示： 注意：透析时间为 12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可 自由进出，而大分子保留在袋内。 (3)纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。 (4)纯度鉴定：一般用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴 定。 3结果分析与评价 【解读步骤解读步骤】 (1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤 采集血样采集血样低速短时间离心低速短时
3、间离心吸取血浆吸取血浆盐水洗涤盐水洗涤低速离心低速离心重复重复步骤三次。步骤三次。 特别提醒特别提醒 (1)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的进行。洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的进行。 (2)离心时转速要低，时间要短，一般为离心时转速要低，时间要短，一般为 500 r/min，离心，离心 2 min。 (3)洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数。 (2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加 40%体积的甲苯，
4、置于磁力搅拌器上充体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充 分搅拌分搅拌 10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心管中，以 2 000 r/min 的速度离心 10 min 后，试管中的溶液分为 4 层： 第 1 层（最上层）：甲苯层（无色透明） 第 2 层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体） 第 3 层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体） 第 4 层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色） 特别提醒特别提醒 (1)将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶
5、性沉淀层。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。 (2)将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的血红蛋白水溶液层。将滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的血红蛋白水溶液层。(4)透析透析 取取 1 mL 的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有 300 mL 的物质的量浓度为的物质的量浓度为 20 mmol/L 的磷酸的磷酸 缓冲液中缓冲液中(pH 为为 7.0)，透析，透析 12 h。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。 2凝胶色谱操作凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作 取长取
6、长 40 cm，内径为，内径为 1.6 cm 的玻璃管，两端需用砂纸磨平。的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：打孔底塞的制作：打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用 100 目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。 顶塞的制作：打孔顶塞的制作：打孔安装玻璃管。安装玻璃管。 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 安装其他附属结构。安装其他附属结构。 特别提醒特别提醒底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以
7、铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白 质分离不彻底。质分离不彻底。 (2)凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶) 固定：将色谱柱垂直固定在支架上固定：将色谱柱垂直固定在支架上 装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内 洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶 12 h (3)样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用量为滴加透析样品：用量为 1 mL样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝胶层样品渗入凝胶床：样品完全渗进凝
8、胶层洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 5 mL 收集一管，连续收集收集一管，连续收集 特别提醒特别提醒 (1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 (2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动， 说明色谱柱制作成
9、功。说明色谱柱制作成功。材料用具：材料用具：猪、牛、羊或者其他脊椎动物的血液，离心管，透析袋，凝胶色谱柱，聚丙烯酰胺凝胶电泳的装置等。探究过程（）：探究过程（）： 探究步骤探究记录结论或解 释1.配制试剂选择相应的化学试剂，配制巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液等。配制巴比妥缓冲液（pH 8.6）1 000 mL（巴比妥 2.76 g， ，巴比妥钠 15.45 g，加蒸馏水定容至 1000 mL） ；配制染色液 100 mL（氨基黑 l0B 0.25 g，甲醇 50 mL，冰醋酸 10 mL，蒸馏水 40 mL） ；配制漂洗液 100 mL（甲醇或乙醇 45 mL，冰醋酸 5 mL，蒸馏水
10、50 mL） ；配制透明液 100 mL（无水乙醇:冰醋酸=7:3） 。2.架滤纸桥按照支架的大小裁剪合适的滤纸条，取双层滤纸条，一端与支架前沿对齐， 另一端浸入电泳槽的缓冲液，待滤纸条湿润后，驱除气泡，使滤纸紧贴于 支架上，即是滤纸桥。3.浸泡薄膜用镊子夹取醋酸纤维薄膜，识别出光泽面，并在光泽面的一角用笔做上记 号，然后放在巴比妥缓冲液中浸泡 20 min。4.细心点样取出薄膜，吸去多余的液体，平铺在玻璃板上，有记号的一面朝下。点样 时用盖玻片在血清中蘸一下，在离薄膜一端 23 cm 处轻轻按下，随即提 起。5.平悬薄膜用镊子夹取薄膜将点样端平贴在电泳槽负极支架的“滤纸桥”上，有记号 的一面
11、朝上，另一端平贴于正极，呈绷直状态。6.实施电泳盖上电泳槽盖，在薄膜平衡约 10 min 后通上电源，电压调至 160 V，每 厘米膜宽电流强度 0.40.8 mA，电泳时间 6090 min。7.染色电泳完毕后切断电泳仪电源，取下薄膜，放入染色液中浸泡 510 min。8.漂洗从染色液中取出薄膜，在漂洗液中漂洗数次，直至蛋白质区底色脱净为止， 即可得到色带清晰的电泳图谱。9.脱色用滤纸压平并吸干薄膜后，再浸入透明液中约 5 min，取出后平贴于玻璃 板上，待完全干燥后便成透明膜，可长期保存。探究反思：探究反思：1简述蛋白质分离的方法及原理。2.在蛋白质的提取和分离（如洗脱等）中通常要用缓冲液
12、，什么是缓冲液？它有什么作用？探究示例：探究示例：红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题： （1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四步：_、_、_和_。（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_。该过程即样品处理，它包括_、_、收集血红蛋白溶液。（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是_。透析的原理是_。（4）通过凝胶色谱
13、法将样品进一步纯化通过凝胶色谱法将样品进一步纯化(如下图如下图)，在操作中加样的，在操作中加样的正确顺序是正确顺序是_，最后经 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是_。血红蛋白有什么特点？_。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意_。【答案】 （1）样品处理；粗分离；纯化；纯度鉴定（2）防止血液凝固红细胞的洗涤，血红蛋白的释放（3）去除分子质量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内 （4） 通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白 除去血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色 来判断什么时候应该收集洗脱液使血红蛋白的分离过程非常直观， 大大简化了实验
14、操作。 【矫正反馈】1.关于电泳概念的理解，错误的是 （ ）A能进行电泳的物质一般是带电颗粒 B带电颗粒向着与其电性相同的电极移动C影响电泳速度的因素包括带电颗粒的性质、电场强度、溶液的pH 等D电泳支持物有滤纸、大分子凝胶、醋酸纤维薄膜等2关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是 （ ）A分离与纯化蛋白质之前首先要用适当的方法使蛋白质释放出来B抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂C蛋白质的粗提取物离心可除去一些小分子杂质D蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物3有关透析的叙述中，错误的是 （ ）A用于透析的薄膜要具有选择透过性 B透析膜一般是由硝酸纤维素制成的C透析能使小分子自由进出，而将大
15、分子保留在袋内 D透析可用于更换样品的缓冲液4下列关于离心沉降的说法中，不正确的是 （ ）A目标不同，需要控制不同的离心速率 B能将分子大小、密度不同的蛋白质分离C离心时，离心管内的溶液量要相同，但不需要对称放置在离心机内D离心后，分子大小、形状不同的蛋白质会分布在不同的沉降层中5带电荷的蛋白质在电场中移动的速度主要取决于 （ ）A所带的电荷多少 B蛋白质的分子大小C蛋白质相对分子质量 D蛋白质的分子大小和所带的电荷多少6下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的说法中，不正确的是 （ ）A加滤纸桥时，待滤纸条湿润后，要驱除气泡，以便使滤纸紧贴于支架上B浸泡薄膜时要识别出光泽面，并做记号C平悬薄膜时，有记号的一面朝上D从染色液中取出薄膜后，用滤纸条压平并吸干，再浸入透明液中脱色7下列关于“DNA 和血红蛋白的提取与
