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1、 活体细胞线粒体形态活体细胞线粒体形态/活性荧光染色试剂盒产品说明书（中文版）活性荧光染色试剂盒产品说明书（中文版）主要用途主要用途 活体细胞线粒体形态/活性荧光染色试剂是一种旨在通过长波长的荧光染料特异性地聚集在线粒体，并呈现红色，用于分析和观察线粒体活性与形态以及双重染色或重叠染色定位的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种线粒体（动物、人体、昆虫等）的形态观察、活性探测和定位标记。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定，滞留持久。 技术背景技术背景 线粒体是细胞中重要的细胞器，其主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量
2、。线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中。大量制备线粒体就是从这些器官组织中提取，或从组织培养细胞中提取。在光学显微镜下线粒体呈现为颗粒状、棒状或弯曲细线。线粒体荧光探针MitoTracker RED，是一种含有硫醇（Thiol）氯甲基基团的荧光染料，自由通过细胞膜，选择性地聚集在线粒体。它可以对活细胞进行直接染色，在 580nm 波长可以清晰看到被染成红色的线状或颗粒小体的线粒体。并可以分析线粒体膜电位，以检测线粒体活性。 产品内容产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 固着液（Reagent B） 毫升 预备液（Reagent C） 毫升 染色液（
3、Reagent D） 微升 产品说明书 1 份 保存方式保存方式 保存染色液（Reagent D）在20冰箱里，避免光照；其余的保存在 4冰箱里；有效保证 6月 用户自备用户自备 完全细胞培养液：用于染色后培养液更换 24 孔细胞培养板：用于贴壁细胞染色的容器 1.5 毫升离心管：用于细胞染色的容器 微型台式离心机：用于沉淀细胞 培养箱：用于染色孵育 （共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析 1实验步骤实验步骤 实验开始前，将20冰箱里的试剂盒中的染色液（染色液（Reagent D）置入冰槽里融化，然后分别移出 微升预备液（预备液（Reagent C）和 微升染色液（染色液（Reagent D）
4、到新的 1.5 毫升离心管，标记为 染色工作液，染色工作液，并放在暗室里备用。然后进行下列操作。 一、 贴壁细胞标准染色一、 贴壁细胞标准染色 1 准备 1 个细胞培养 24 孔板的待测细胞，细胞铺满率达 70 （注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项12） 2 小心抽去细胞培养液 3 小心沿着孔壁加入 500 微升 37预热的用户自备的完全细胞培养液到细胞培养孔，覆盖培养孔表面 4 小心加入 微升含有预备液 （预备液 （Reagent C） 和染色液 （染色液 （Reagent D） 的染色工作液染色工作液，小心摇动培养板，使其混匀（注意：参见注意事项
5、9和10） 5 放进 37细胞培养箱里孵育 20 分钟 6 小心抽去含有染色工作液染色工作液 的细胞培养液 7 小心沿着孔壁加入 1 毫升 37预热的用户自备的完全细胞培养液到细胞培养孔 8 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察：激发波长 579nm，散发波长 599nm（线粒体呈现红色） 二、 贴壁细胞快速染色二、 贴壁细胞快速染色 1 准备 1 个细胞培养 24 孔板的待测细胞，细胞铺满率达 70 （注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项12） 2 直接加入 微升 （1： 500 容量比） 含有预备液 （预备液 （Reagent C） 和染色液 （染色液
6、（Reagent D）的染色工作液染色工作液到 1 毫升培养液里，小心摇动培养板，使其混匀（注意：参见注意事项9和10） 3 放进 37细胞培养箱里孵育 20 分钟 4 小心抽去含有染色工作液染色工作液的细胞培养液 5 小心沿着孔壁加入 1 毫升 37预热的用户自备的完全细胞培养液到细胞培养孔 6 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察：激发波长 579nm，散发波长 599nm（线粒体呈现红色） 三、 悬浮细胞或脱离细胞染色三、 悬浮细胞或脱离细胞染色 1 将悬浮细胞或脱离细胞（1 X 106细胞）移入到 1.5 毫升离心管 2 放进微型台式离心机离心 1 分钟，速度为 300g（或 2000RPM
7、，例如 eppendorf 5415） 3 小心抽去上清液 4 加入 500 微升 37预热的用户自备的完全细胞培养液 5 加入 微升含有预备液（预备液（Reagent C）和染色液（染色液（Reagent D）的染色工作液染色工作液，充分混匀（注意：参见注意事项9和10） 6 放进 37细胞培养箱里孵育 20 分钟 7 放进微型台式离心机离心 1 分钟，速度为 300g（或 2000RPM，例如 eppendorf 5415） 8 加入 100 微升 37预热的用户自备的完全细胞培养液，混匀 9 移出 5 微升到载玻片上，放上盖玻片 10（选择步骤）如果需要双重染色，移出 3.5 微升染色细
8、胞到载玻片上 211（选择步骤）加入 1 微升用户需测的第二染料，放上盖玻片 12（选择步骤）放进 37细胞培养箱里孵育 10 分钟 13即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长 579nm，散发波长 599nm（线粒体呈现红色） 四、细胞双重染色四、细胞双重染色 1 准备 1 个载玻片培养皿的待测细胞 2 小心抽去细胞培养液 3 小心加入 1 毫升 37预热的用户自备的完全细胞培养液 4 小心加入 微升含有预备液 （预备液 （Reagent C） 和染色液 （染色液 （Reagent D） 的染色工作液染色工作液，小心摇动培养皿，使其混匀（注意：参见注意事项9和10） 5 放进 37细
9、胞培养箱里孵育 20 分钟 6 小心抽去含有染色工作液染色工作液的细胞培养液 7 小心加入 微升 37预热的清理液（清理液（Reagent A） 8 小心抽去清理液（清理液（Reagent A） 9 （注意：由此步骤开始，用户可以进行其它膜通透性荧光染料的标记;如果是膜不通透性荧光染料，继续下列操作） 10小心加入 微升 37预热的清理液（清理液（Reagent A） 11小心加入 微升 固着液（固着液（Reagent B） ，小心摇动培养皿，使其混匀 12放进 37细胞培养箱里孵育 15 分钟 13小心抽去含有固着液（固着液（Reagent B）的清理液（清理液（Reagent A） 14小
10、心加入 毫升 37预热的 清理液（清理液（Reagent A） 15小心抽去清理液（清理液（Reagent A） （注意：由此步骤开始，用户可以进行抗体荧光染色或膜不通透性荧光染料的通透和标记） 16在荧光显微镜下进行观察 四、 细胞固定染色四、 细胞固定染色 1准备 1 个细胞培养 24 孔板的待测细胞，细胞铺满率达 70 （注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项12） 2 小心抽去细胞培养液 3 小心沿着孔壁加入 500 微升 37预热的用户自备的完全细胞培养液到细胞培养孔，覆盖培养孔表面 4 小心加入 微升固着液（固着液（Reagent B） ，小
11、心摇动培养板，使其混匀 5 放进 37细胞培养箱里孵育 15 分钟 6 小心抽去含有 固着液（固着液（Reagent B）的细胞培养液 7 小心加入 微升清理液（清理液（Reagent A） 8 小心抽去清理液（清理液（Reagent A） 9 再加入 微升清理液（清理液（Reagent A） 10小心加入 2 微升含有 预备液（预备液（Reagent C）和 染色液（染色液（Reagent D）的染色工作液染色工作液，小心摇动培养板，使其混匀（注意：参见注意事项10） 11放进 37细胞培养箱里孵育 20 分钟 12小心抽去含有染色工作液染色工作液的清理液（清理液（Reagent A） 13
12、加入 微升新鲜的清理液（清理液（Reagent A） 14小心抽去 清理液（清理液（Reagent A） 315再加入 微升清理液（清理液（Reagent A） 16即刻在倒置荧光显微镜下进行观察：激发波长 579nm，散发波长 599nm（线粒体呈现红色） 五、 切片染色五、 切片染色 1 准备 1 个待测的切片样品 2 小心加上 微升清理液（清理液（Reagent A） ，覆盖切片表面 3 小心移去切片上的清理液（清理液（Reagent A） 4 小心加上 微升清理液（清理液（Reagent A） ，覆盖切片表面 5 小心加入 微升固着液（固着液（Reagent B） 6 室温下孵育 10
13、 分钟 7 小心移去切片上的固着液（固着液（Reagent B） 8 小心加上 微升清理液（清理液（Reagent A） ，） ，覆盖切片表面 9 小心移去切片上的清理液（清理液（Reagent A） 10移取 微升清理液（清理液（Reagent A）到新的 1.5 毫升离心管 11加入 微升含有预备液（预备液（Reagent C）和染色液（染色液（Reagent D）的染色工作液，染色工作液，混匀（注意：参见注意事项10） 12小心加上上述染色工作液染色工作液到切片上，覆盖切片表面 13放进 37细胞培养箱里孵育 20 分钟 14小心移去切片上的 染色工作液染色工作液 15小心加上 微升新鲜
14、的清理液（清理液（Reagent A） 16小心移去清理液（清理液（Reagent A） 17盖上盖玻片 18即刻在荧光显微镜下进行观察：激发波长 579nm，散发波长 599nm（线粒体呈现红色） 注意事项注意事项 1 本产品为 100 次（固定染色）和 200 次（活体染色）操作 2 操作时，避免污染母液 3 操作时，须戴手套 4 染色前，所有试剂溶液（除 染色液染色液外）需 37预热 5 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析 6 孵育时，必须避免光照 7 剩余的染色工作液可放进20储存备用 8 本产品适合活体染色和固定染色，染色剂不易洗掉，染色持久 9 活细胞染色：1 毫升体系可以使
15、用 1 微升（1：1000 容量比）含有 预备液（预备液（Reagent C）和染色液（染色液（Reagent D）的 染色工作液染色工作液 10根据不同细胞类型，调整染色工作液染色工作液的使用剂量（1：100 至 1：1000 容量比） ，避免过度染色 11本产品友好使用于双重染色或重叠染色 12本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm 培养皿，和各种培养孔板，须相应调整处理液： 操作容器操作容器 建议操作体系建议操作体系 载玻片 100 微升 4载玻片培养皿 1 毫升 35mm 培养皿 1 毫升 96 孔培养板 100 微升 48 孔培养板 200 微升 24 孔培养板 500 微升 12 孔培养板 1 毫升 6 孔培养板 2 毫升 25cm2细胞培养瓶 3 毫升 13本公司提供系列线粒体分析试剂产品 质量标准质量标准 1 本产品经鉴定性能稳定 2 本产品经鉴定荧光清晰
