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1、三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文分类号 R392 密级 公开U D C硕 士 学 位 论 文血管紧张素及氧化低密度脂蛋白对大鼠血管平滑肌细胞中 Smad4表达的影响学 位 申 请 人： 褚 昀 赟学 科 专 业 ： 免 疫 学指 导 教 师 ： 刘先哲教授二 一 二 年 五 月1三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for theDegree of Master of MedicineStudy on the Effects of Angiotensin
2、 And OxidizedLow-density Lipoprotein on Smad4 Expression inCultured Rat Vascular Smooth Muscle CellsGraduate Student: Chu Yun YunMajor: immunologySupervisor: Prof. Liu Xian ZheChina Three Gorges UniversityYichang, 443002, P.R.ChinaMay, 20122三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文三 峡 大 学 学 位 论 文 原 创 性 声 明本 人 郑 重 声 明 ： 所
3、 呈 交 的 学 位 论 文 ， 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下 ， 独 立 进 行 研 究 工 作所 取 得 的 成 果 ， 除 文 中 已 经 注 明 引 用 的 内 容 外 ， 本 论 文 不 含 任 何 其 他 个 人 或 集 体 已 经发 表 或 撰 写 过 的 作 品 成 果 。 对 本 文 的 研 究 做 出 重 要 贡 献 的 个 人 和 集 体 均 已 在 文 中 以 明确 方 式 标 明 ， 本 人 完 全 意 识 到 本 声 明 的 法 律 后 果 由 本 人 承 担 。学 位 论 文 作 者 签 名 ：日 期 ：三 峡 大 学 研 究 生 知 识 产 权 承 诺
4、 书本 人 承 认 ： 我 作 为 三 峡 大 学 硕 士 研 究 生 在 校 学 习 期 间 ， 在 导 师 指 导 下 ， 依 据 研 究工 作 所 作 学 位 论 文 的 知 识 产 权 全 部 权 归 三 峡 大 学 所 有 。本 人 承 诺 ： 我 有 义 务 维 护 三 峡 大 学 的 知 识 产 权 ， 凡 是 以 我 本 人 学 位 论 文 内 的 全 部或 部 分 研 究 成 果 ， 或 实 验 数 据 为 基 础 所 形 成 的 研 究 论 文 及 成 果 ， 无 论 是 以 何 种 形 式 刊发 学 术 论 文 、 进 行 成 果 鉴 定 或 申 报 奖 励 ， 均 以
5、三 峡 大 学 为 第 一 作 者 单 位 或 完 成 单 位 ，并 事 先 征 得 导 师 或 学 校 相 关 部 门 的 同 意 。我 愿 承 担 因 违 背 上 述 承 诺 而 引 起 的 一 切 法 津 和 经 济 后 果 。学 位 论 文 作 者 签 名 ：日 期 ：I三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文内 容 摘 要目 的 ： 通 过 研 究 不 同 浓 度 的 血 管 紧 张 素 （ angiotensin ， AngII） 及 氧 化 低 密 度脂 蛋 白 （ oxidized low-density lipoprotein， ox-LDL）对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞 中
6、 （ vascular smooth muscle cells， VSMCs） Smad4 表 达 的 影 响 ， 来 探 讨 影 响 转 化 生长 因 子 -（ transforming growth factor-, TGF-） 信 号 通 路 的 不 同 因 素 ， 从 而 进 一 步探 讨 导 致 高 血 压 和 动 脉 粥 样 硬 化 形 成 不 同 病 变 的 作 用 机 制 ， 分 析 影 响 粥 样 斑 块 稳 定 性的 因 素 ， 并 期 望 为 动 脉 粥 样 硬 化 的 治 疗 找 到 新 的 靶 点 。方 法 ： 取 3-10 代生长状态良好的 VSMCs 进 行 培
7、养 ， 每 瓶 接 种 DMEM 液 5ml（ 含 10%胎 牛 血 清 、 100U /ml 青 霉 素 、 100g/ml 链 霉 素 、 200mmol/L L-谷 氨 酰 胺 ），待 细 胞 贴 壁 生 长 至 70%-80%融 合 时 ， 改 用 无 血 清 的 DMEM（ 含 0.2%胎 牛 血 清 ） 培 养24 小 时 ， 使 其 同 步 化 在 静 止 期 。 然 后 分 为 五 组 ： 对 照 组 、 TGF-1 作用组、 AngII 作用 组 、 ox-LDL 作用组、AngII 及 ox-LDL 联 合 作 用 组 。 按 实 验 方 案 给 予 不 同 浓 度 药 物
8、作 用 24 小 时 后 ， 采 用 RT-PCR 和 western blot 方 法 检 测 各 组 细 胞 中 Smad4 基 因 及 蛋 白的 表 达 量 ， 用 ELISA 法 检 测 各 组 细 胞 上 清 液 中 型 胶 原 的 表 达 ， 最 后 利 用 SPSS13.0软 件 包 对 各 组 数 据 进 行 统 计 学 分 析 ， P0.05 被认为差异有统计学意义。结 果 ： RT-PCR 和 western blot 检 测 不 同 浓 度 TGF-1（ 1、 5、 10g/L） 作 用 于 VSMCs后 ， 细 胞 中 Smad4 的 表 达 量 均 高 于 对 照 组
9、 （ P0.05） ， ELISA 检测细胞上清液中型胶原 的 浓 度 高 于 对 照 组 。 在 这 基 础 之 上 ， RT-PCR 和 western blot 检测不同浓度 AngII（ 10-7、10-6、 10-5 mol/L） 作 用 于 VSMCs 后 ， 细 胞 中 Smad4 的 表 达 量 均 高 于 对 照 组 （ P0.05） ，细 胞 上 清 液 中 型 胶 原 的 浓 度 高 于 对 照 组 ； 不 同 浓 度 ox-LDL(20、 40、 80mg/L)作 用 大鼠 VSMCs 后 ， 80mg/L ox-LDL 组 同 对 照 组 相 比 ， 细 胞 中 Sm
10、ad4 的 表 达 量 明 显 下 降（ P0.01） ， 细 胞 上 清 液 中 型 胶 原 的 浓 度 低 于 对 照 组 ； 以 AngII（ 10-5mol/L） 联 合 不同 浓 度 ox-LDL(20、 40、 80mg/L)作 用 大 鼠 VSMCs 后 ， 同 AngII10-5mol/L 组 相 比 ， 联 合组 Smad4 的 表 达 量 下 降 （ P0.05） ， 细 胞 上 清 液 中 型 胶 原 的 浓 度 有 所 降 低 。结论：（ 1） AngII 促 进 大 鼠 VSMCs 中 Smad4 的表达以及细胞上清液中 型胶原的表达, 表 明 AngII 对 TGF
11、- 胞 内 信 号 通 路 有 促 进 作 用 ； （ 2） ox-LDL 抑制 Smad4 及细胞上 清 液 中 型 胶 原 的 表 达 ； （ 3） ox-LDL 下 调 AngII 促 进 大 鼠 VSMCs 中 Smad4 及 细 胞上 清 液 中 型 胶 原 的 表 达 作 用 ， 并 呈 浓 度 依 赖 性 。关键词：血管平滑肌细胞 血管紧张素 氧化低密度脂蛋白 转化生长因子 Smad4II三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文AbstractObjective: To investigate angiotensinII(AngII) and oxidized low-densit
12、ylipoprotein(ox-LDL) regulate the expression of Smad4 in cultured rat vascular smoothmuscle cells(VSMCs)， and to explore factors which affect the expression and activation oftransforming growth factor-(TGF-) indirectly. So that we try to illustrate the differentpathogenesis between hypertension and
13、atherosclerosis, and analysis what the factors affectthe stability of atheromatous plaque.We want to find an anticipant way for atherosclerosistreatment.Methods: VSMCs were cultured in DMEM containing 10% fetal calf serum,100U/ml penicillin, 100g/ml streptomycin, and 200mmol/L L-glutamine. For allex
14、periments, VSMCs (passage 310) were grown to 7080% conuence and madequiescent by serum starvation (0.2% FBS/DMEM) for 24h. Culture mediums were thenchanged followed by stimulation with TGF-1,AngII or/and ox-LDL for 24h as indicated.Smad4 mRNA and protein expression were examined by RT-PCR and wester
15、n blot.Collagen type was determined using ELISA.All statistical analyses were preformedusing SPSS13.0 software. Differences with P0.05 were considered as statisticallysignificant.Results: TGF-1 (1、 5、 10g/L)enhanced Smad4 expression(vs control, P0.05)andcollagen type .AngII(10-7 、 10-6 、 10-5mol/L)e
16、nhanced Smad4 expression(vs control,P0.05)and collagen type . While ox-LDL(80mg/L) decreased Smad4 expression(vscontrol,P0.01) and collagen type .ox-LDL concentration-dependently downregulatedAngII-induced Smad4 expression (vs AngII 10-5mol/L, P0.05) and collagen type .Conclusions: 1) AngII upregulates the expression of Smad4 and collagen type incultured VSMCs.So the AngII stimulates th
