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1、小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展摘要 综述了有关于小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法的研究进展,阐述了乳腺细胞培养 的意义,介绍了乳腺组织原代培养的过程, 并分析了所取得的研究成果。 关键词 小鼠;乳腺上皮细胞;原代培养;细胞工程原代培养即直接从有机体摘取细胞、组 织或器官,使其在体外维持与生长。合适的培养条件对体 外培养细胞的生存和增殖都十分重要。一般而言,不同动 物、不同组织器官来源的细胞对培养条件的要求存在一定差 异,因此,需要使体外环境下的培养条件尽可能地模拟体内 环境。体内乳腺组织的增殖、分化和组织结构重塑受内环境 (如类固醇、生长因子、结合蛋白及细胞外基质间复杂的相互 作用等
2、)因素的影响和作用,这些因素同样也影响体外培养 乳腺上皮细胞的增殖分化和功能表现。对于某种动物特 定组织细胞的体外培养,对培养液、添加因子、附着底物及培 养温度、pH 值等都需进行仔细的选择,乳腺上皮细胞的体外 培养建立在乳腺上皮原代培养细胞的基础上,针对不同的研 究目的应采取不同的培养方法,以对细胞进行分化诱导。 张以涛比较了不同 pH 值、不同血清浓度配比的生长培养液 对小鼠乳腺上皮细胞生长的影响,结果表明, pH 值 7. 4 含 10%血清的培养基为最佳生长液。现代研究普遍认为,内 分泌激素在乳腺上皮细胞发育各个阶段都发挥影响作用,不 同时期乳腺组织的形态、组成及功能均有差异,这对选择
3、乳 腺上皮细胞体外培养的取材时间有指导意义。张以涛比 较了取自不同时期乳腺上皮细胞的生物学特性,得出妊娠期 细胞生存、增殖能力均强于泌乳期细胞,妊娠期小鼠乳腺为 获得细胞的最佳取材时期。乳腺上皮细胞的原代培养,首 先是尽可能地分离出乳腺上皮细胞,同时减少分离过程对细 胞的损伤和浪费,以及通过采用一定的方法,使最终得到富 集的乳腺上皮细胞及杂质细胞尽可能少甚至被完全清除。 1 乳腺细胞培养的意义 将动物细胞或组织在体外进行培养,能有效排除神经体 液等因素对其造成的影响,可直接进行药物对细胞的活动代 谢、毒性和杀伤作用等检测,如秦君等以王不留行为试验材 料,对其 3 类主要成分(皂甙类、黄酮甙类及
4、香豆素类)进行 提取,分别以不同浓度添加到细胞培养液中,寻找王不留行 促进泌乳的有效成分。与细菌相比,可合成并分泌蛋白质 的细胞具有修饰功能,若对外源基因进行表达,则可生产出 许多与人类健康和生存密切相关的生物技术产品。自从 Gordon 等应用转基因技术从哺乳期小鼠的乳腺中分泌人组 织源性纤维酶原激活剂以来,对乳腺生物反应器的研究得到 了迅速发展,让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达,使转基因动物的乳腺组织可直接生产药用蛋白已成为近年 来生物技术领域新的研究热点,世界各国对转基因动物乳腺 生物反应器的研究极为重视。利用人工培养的动物细胞 繁殖病毒,大大减少了用病毒直接在动物体进一步繁殖而造
5、成的经济损失。此外,乳腺上皮细胞是乳腺的主要组成和分 泌功能成分,而乳腺癌属高发病,国内外许多研究者都研究 乳腺癌的发生发展机理,这使乳腺上皮细胞培养进一步受到 了重视。 细胞培养工程正在逐步形成一支独特的高新技术产业, 并显示出巨大的工业发展前景。许多科学家把乳腺视为 一种理想的试验模型系统,用以研究解决许多基础原理问 题,其涉及的领域有细胞生物学、发育生物学及内分泌学、生 物化学与分子生物学等学科,为医药产业开创了一个新的 制药途径。乳腺细胞培养是研究构建模型系统的基础,为研 究提供了大量上皮细胞。 2 乳腺组织原代培养的过程 2. 1 乳腺上皮细胞的原代培养要点 乳腺的间质和实质的 基本
6、结构随发情周期的改变而改变,静止期乳腺脂肪细胞和 结缔组织多,间质发达;活动期尤其在妊娠期乳腺实质发达, 腺泡数量增多且变大。在母畜妊娠中期,发育中的腺泡出 现分泌腔,腺泡和导管的体积不断增大,同时乳房内的血管 和神经纤维不断增生,且在这个时期所采集的乳腺组织 中所含杂质,如脂滴和结缔组织相对较少,这大大降低了乳 腺细胞体外培养的劣势。因此,对小鼠乳腺细胞的体外培养 取材,大多采用妊娠中期小鼠乳腺,能得到相对较多的乳腺 腺泡细胞,妊娠期小鼠乳腺细胞增殖能力旺盛,适合于传代 培养。 当前,原代乳腺上皮细胞培养大都采用组织块培养法及 胶原酶消化法。李震等比较了几种乳腺细胞分离培养方 法的特点,证明
7、了胶原酶消化法和组织块种植法均可用于动 物原代乳腺细胞的培养,且比较了这 2 种方法的优缺点,结 果表明,胶原酶消化法容易得到均匀的乳腺细胞,且上皮细 胞所占比例也较高;组织块培养法不容易丢失,不易损伤上 皮细胞,上皮细胞长出较晚,且所占比例较低;组织块直接培 养法操作过程简单,但细胞从组织块长出所需时间较长,成 纤维等结缔组织细胞最先长出,随后出现含上皮细胞丰富的 细胞单层,该方法比较适合于小动物(如小鼠)的乳腺细胞 培养。 乳腺细胞原代培养过程中,常常伴随着成纤维细胞的生 长,因此需要在之后的传代培养中进行纯化。然而,对于小 鼠乳腺细胞而言,其具有生长缓慢,老化速度快,纯化难等特 点,符合
8、要求的乳腺上皮细胞系很难建立。最早得到公认的 细胞系是 1984 年获得的 COMMA21D 小鼠乳腺上皮细胞 系,该细胞系在合适的培养条件下可以合成乳蛋白。Ball等在 COMMA21D 的基础上分离得到小鼠乳腺细胞系 HC11;已获得的机能正常且非瘤性小鼠乳腺上皮细胞系 还有小鼠乳腺细胞系 NMuMG 15 , C57MG cells 16 ,NOG8 17 , EpH4 18 , CID29 19 , SCp2 20 , FSK cell 21 , Fos2ER 22 等。 2. 2 小鼠乳腺上皮细胞原代培养 2. 2. 1 小鼠乳腺组织的采集与处理。 2. 2. 1. 1 小鼠乳腺组织
9、的采集。用 CO2 窒息法处死妊娠中 期小白鼠,置于 75%乙醇中浸泡消毒;将小鼠四肢固定在蜡 盘上,用灭菌的手术器械呈“V”字型,沿小鼠腹中线剪开腹 部皮肤,用镊子牵拉开皮肤并用大头针固定住,暴露左右各 5 个乳腺组织部位;尽量避开淋巴结和肌腱,将乳腺组织小心 剥离,放入灭过菌的烧杯中。 2. 2. 1. 2 乳腺组织的处理。用 PBS 液漂洗乳腺组织,以 除去油脂及血液,留少许 PBS 液于容器内,保证乳腺组织的 活力。若采用组织块培养法,则将乳腺组织剪切成小于 1 mm3 组织块,因为体积大于 1 mm3 的组织块在培养液中仅有 处于其边缘的少量细胞能获得营养而得以生存和生长,而大 部分
10、内部细胞因营养物质穿透有限而代谢不良,且受纤维成 分束缚而难以移出。若采用酶消化法,用眼科剪直接将 乳腺组织剪成均匀一致的糊状物,以便组织充分接触到消化 液,消化结束后,再用 PBS 液漂洗 2 次,离心收集沉淀的细 胞团。 2. 2. 2 小鼠乳腺上皮细胞原代培养的一般方法。 2. 2. 2. 1 组织块种植法。吸取已处理好的组织小块于进口 培养皿底部,并按 0. 5 cm 左右的间距均匀种植。轻轻翻转 培养瓶,瓶底向上,将其置于 37 、5%CO2 培养箱内 2 h 左 右,使组织小块微干涸贴壁,然后将培养瓶从培养箱取出,轻 轻加入少许 20%生长液,使培养液缓缓浸过瓶底上的组织小 块,尽
11、量避免冲洗掉已贴壁的小块。随后将培养瓶静置于培 养箱内培养,待细胞从组织块游出数量增多后,再换掉或补 加培养液。 2. 2. 2. 2 胶原酶消化法。将乳腺组织糜转入离心管并加入 5 倍体积的 0. 2%胶原酶消化液于 37 中进行消化。每 0. 5 h 振荡 1 次或用吸管吹打 1 次,使细胞分离。3 h 左右消 化液中已无明显大块组织,用移液管将消化的乳腺组织吹 散, 100 目不锈钢细胞筛网过滤除去杂质; 3 次离心( 1 500 r/min, 2 min)清洗收集细胞,用少量生长培养液将收集的细 胞吹成单细胞和小细胞团块,转入进口培养皿或培养板,并 置于 5%CO2、37培养箱中培养,
12、视细胞生长状况换液或 传代。 2. 2. 3 纯化方法。上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞, 培养时其生长速度往往超过上皮细胞,且难纯化,随传代的 不断进行,上皮细胞逐渐被生长较快的成纤维细胞取代。 同时,上皮细胞难以在体外长期生存,因此,纯化和延长生存时间是培养关键。 利用成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶敏感性不同及 贴壁时间差异,对原代培养的乳腺上皮细胞进行纯化培养, 即利用上皮细胞与培养瓶的结合力比成纤维细胞牢固的特 点,用胰酶/EDTA 溶液轻微消化去除成纤维细胞。但在实 际操作中,该方法很难在小鼠乳腺上皮细胞的培养中完成纯 化。通过密度梯度离心收集腺上皮细胞,可得到较纯净的上 皮细胞,但
13、该方法往往损失大量细胞。Medina 等和 Matitashvili 等通过加入压绷氨酸或霍乱毒素选择性培养 液,以促进上皮细胞的生长和抑制成纤维细胞的增殖;彭新 荣等在对牛乳腺上皮细胞进行体外培养时,用细胞刮刀 刮去大部分成纤维细胞。陶海静等在组织块培养过程中 利用组织块转培法,即选择以上皮细胞生长为主的组织块, 用灭菌铜针将其挑出,转移至另一培养瓶中进行培养;结合 胰酶/EDTA 消化法除去成纤维细胞,从而得到了上皮细胞富 集的细胞系。 2. 2. 4 在细胞培养前的纯化。以上纯化时机都在细胞长出 后进行,这时同乳腺上皮细胞生长的有大量成纤维细胞,它 们对维持乳腺上皮细胞分化状态起着积极作
14、用,同时可形成 类似乳腺组织的二维空间结构,但这些成纤维细胞一方面 成为杂质细胞,对某些单纯需要乳腺上皮细胞的研究会造成 干扰甚至阻碍,另一方面,乳腺上皮细胞会被生长迅速的成 纤维细胞取代,这样也不利于研究中对乳腺上皮细胞的利 用,因此在乳腺上皮细胞原代培养的研究中便诞生了新方 法。胰蛋白酶、胶原酶分段消化。有研究表明,采用胶原 酶、链霉蛋白酶分段消化乳腺组织,可得到纯上皮细胞。张 以涛等在进行小鼠乳腺上皮细胞原代培养时,先将 1 g 乳 腺组织加入 0. 125%胰蛋白酶于 37 消化 2025 min,然后 用含 5100%血清的 DMEM /F12 洗涤液漂洗 1 次,最后加入 胶原酶溶
15、液于 37 培养 2025 min, 6 层消毒纱布过滤后离 心(1 500 r/min, 2 min)收集细胞,用该法得到了富集的乳腺 上皮细胞。5%FCS 洗纯。Kittrell 等将切碎的小鼠乳腺 组织用 0. 15%胶原酶于 37 消化 34 h,离心后的细胞沉 淀用含 5%胎牛血清的 PBS 清洗 4 遍以除去胶原酶,Virginia 等对 Kittrell 等的方法进行了改良,将小鼠乳腺组织切 碎后,放入含胰岛素及抗生素的由 DMEM /F12 配制的 A 型 胶原酶中,于 37 振荡消化 3 h, 1 000 g 离心 10 min 收集细 胞沉淀,加入 DNA 酶轻摇消化 2
16、min,用含 4%胎牛血清的 DMEM /F12 培养基稀释 DNA 酶,再次 1 000 g 离心 10 min 收 集细胞沉淀,接着用含 5%成牛血清的 PBS 重悬浮细胞,并 用该介质 1 500 g 离心 15 s,重复 6 次,可以除去基质细胞,最 终能够得到纯度为 90%以上的乳腺上皮细胞。 3 结果与分析 乳腺细胞在铺有人工基底物或塑胶基底上生长和繁殖 32 - 33 ,因此在培养小鼠乳腺上皮细胞时可使用进口细胞 培养器材。按照乳腺上皮细胞原代培养的一般方法培养出 来的细胞中,除了乳腺上皮细胞外,还含有大量的成纤维细 胞(图 1a) ;经胰蛋白酶、胶原酶分段消化,并用 5% PBS 洗纯 后的细胞贴壁生长后,在镜下可见细胞形态均一,呈岛屿状 或铺路石样生长,且在乳腺上皮细胞岛边缘,几乎无扁平、多 突起呈星状的成纤维样细胞(图 1b) 。对于乳腺细胞生长增殖而言,添加因子具有十分重要的 注: a 为混有成纤维细胞的体外培养的多乳腺上皮细胞,图中黑框部分显示混杂生长的扁平、 多突起呈星状成纤维细
