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1、科學與工程技術期刊科學與工程技術期刊 第十三卷第十三卷 第一期第一期 民國一六民國一六年年 Journal of Science and Engineering Technology, Vol. 13, No. 1, pp.35-45 (2017) 35 甘蔗渣廢棄物甘蔗渣廢棄物為為原料以發酵原料以發酵生產生產- -聚麩氨酸聚麩氨酸之研究之研究 吳芳禎1 王政捷2 施英隆2* 1大葉大學生物產業科技學系 2大葉大學環境工程學系 51591 彰化縣大村鄉學府路 168 號 *ilsmail.dyu.edu.tw 摘摘 要要 以微生物發酵生成之高分子具功能性、生物相容與生物可分解性，是一種非石化資
2、源相關之再生材料，使用時對人體是無害且不會對環境造成污染，因此近年來極受重視。結合生質精煉技術與再生性生質原料為基礎以開發生物高分子材料但可解決環境問題，同時可生產高經濟價值之產品。本研究建立以甘蔗生質為原料並透過生質與發酵過程生產聚胺基酸類之生質材料，結果發現 Bacillus subtilis D1 可利用蔗渣水解液生產高分子化合物。B. subtilis D1 在蔗渣水解液 （含葡萄糖 7.1 g/L 與木糖 2.8 g/L） 經 96 h 發酵，可得 -PGA 9.10.1 g/L，產率為 0.510.12 g /g（L-glutamate） 。所得之-PGA 經純化後可得純-PGA
3、7.9 g/L，其平均分子量（Mn）為 2 x 106 Da。氨基酸分析與1H-NMR、13C-NMR 之光譜分析證明純化後之-PGA 純度相當高（ 96%） ，光學異構物之組成比例（D-麩氨酸/L-麩氨酸）比例為 56/44，且比例會隨著培養基中添加之 Mn2+濃度變化而變化。實驗亦證明本研究之蔗渣水解反應所產生之水解液不會抑制後續之發酵反應，因此極適合作為發酵原料以生產有價值之生化產品。以甘蔗生質為原料並透過生質與發酵過程生產聚胺基酸類之生質材料但可解決環境問題，又可生產高經濟價值之生化產品，有極高之價值。 關鍵詞：關鍵詞：甘蔗渣，生物精煉，水解液，發酵，生物高分子，聚麩胺酸 Bioref
4、inery of Sugarcane Bagasse for-Poly（Glutamic Acid） Production FANG-CHEN WU1, ZERN-JAI WANG2 and ING-LUNG SHIH2* 1Department of Bioindustry Technology , Da-Yeh University 2Department of Environmental Engineering, Da-Yeh University No. 168 University Rd., Dacun, Changhua 51591, Taiwan, R.O.C. *ilsmail
5、.dyu.edu.tw ABSTRACT As fossil fuel supplies dwindle and environmental awareness increases, the biorefinery process has become the most promising method for producing alternatives to fossil fuels and traditionally 科學與工程技術期刊科學與工程技術期刊 第十三卷第十三卷 第一期第一期 民國一六民國一六年年 36 oil-based chemicals. In particular, t
6、he microbial conversion of biomass for the production of biopolymers is an attractive option because of the high marketing demand for degradable biopolymers and the high quantity of available renewable biomass feedstocks. This study investigated batch cultivation on the production of -poly（glutamic
7、acid）（-PGA）by Bacillus subtilis D1 by using a hydrolysate of bagasse as feedstock. It was observed that B. subtilis D1 can effectively employ glucose and xylose for -PGA production. When B. subtilis D1 was cultivated in bagasse hydrolysate ME9（containing 7.1 g/L of glucose and 2.8 g/L of xylose）, 9.
8、1 0.1 g/L of -PGA（yield of 0.51 0.12 g/g L-glutamate）could be obtained. The quality of -PGA produced was comparable to an authentic sample obtained from conventional fermentation. Moreover, 7.9 g/L of the purified -PGA was obtained, and its average molecular weight（Mn）was 2 x 106 Da. Amino acid anal
9、ysis and 1H-NMR and 13C-NMR spectra revealed its high purity. The ratio of the optical isomer（D-glutamic acid/L-glutamic acid）was 56/44, and it varied with the concentrations of Mn2+ supplemented in the medium. Experiments further confirmed that no or low concentration of harmful inhibitors was pres
10、ent in the bagasse hydrolysate, thereby rendering it a suitable material for the production of valuable bioproducts in the subsequent fermentation. The biorefinery of bagasse into biopolymers is a sustainable process that can not only solve environmental problems, but also produce high value-added b
11、ioproducts. Key Words: Bagasse, biorefinery, hydrolysate, fermentation, biopolymer, -poly（glutamic acid） 一、一、前言前言 近幾由於全球暖化、環保意識抬頭、化石燃之即將用罄與原油價格日漸提升，使得尋找經濟、有效、能永續之替代能源與可再生用之生質原以取代傳統石化原以為因應，已是追求永續發展與永續經濟之重要課題 16, 41, 54。以微生物發酵生成之高分子具功能性、生物相容與生物可分解性、是一種非石化資源相關之再生材料。這些材料之使用對人體無害且不會對環境造成污染 ， 因此近年來極受重視。已知
12、其可用於食品、化妝品、醫藥及環保等領域之應用1, 46-47。生物質是一種重要的再生資源，有取之不盡、用之不竭的特性。由於作物的生長可以吸收二氧化碳，減少溫室氣體的累積，且所使用材料多為廢棄物，可降低對環境之衝擊。 結合生質精煉技術與再生性生質原料為基礎以開發生物高分子材料但可解決環境問題 ， 同時可生產高經濟價值之產品，如此對環境友善之色製程，值得開發 5, 11, 18-19, 21-22, 31, 48, 51。 -聚麩氨酸（-Poly (glutamic acid);-PGA）是為一結構極為特殊，且可由微生物代謝合成而得之一天然聚合物，其係由 D 及 L 麩氨酸經由-胺基及-羥基鏈結聚
13、合而成，結構異於一般蛋白質之天然高分子 4, 47。-PGA 具有水溶 、 可食及生物可分解等特性且其本身或分解之產物對人體無害，因此近年來已有相當多之研究著重於開發聚麩氨酸及其衍生物於食品、化妝品、醫藥及環保等領域之應用且已有極多成果。目前已知其可為抗癌藥物、基因藥物之載體 17, 35、手術之止血劑及癒合劑 25-26, 43-44、化妝品之保濕劑 9、食品之增稠劑 55及抗凍劑 38, 50、廢水處理之絮凝劑 8, 49及重金屬離子與放射性物質之吸附劑 10, 27, 36-37，也可為強力吸水材料及薄膜材料 13, 33, 39。 因此本研究擬建立以甘蔗生質為原料並透過生質與發酵過程生
14、產聚胺基酸類之生質材料。 二、二、 材料與方法材料與方法 （一一）菌種菌種 本研究所使用之聚麩氨酸生產菌株為 Bacillus subtilis D1 係由大葉大學聚麩氨酸研究團隊由味精廢水篩選之菌株 3 。 Bacillus licheniformis CCRC12826 （ 現 為 Bacillus licheniformis BCRC12826）為研究-PGA 發酵常被使用之菌株 47-50，因此在本研究中亦一併探討以與 B. subtilis D1 進行比較。 （二二）甘蔗渣水解方法甘蔗渣水解方法 蔗渣水解採用已知之水解方法 2。蔗渣經 0.25 N 硫吳芳禎吳芳禎、王政捷王政捷、施英
15、隆施英隆：甘蔗渣廢棄物為原料以發酵生產甘蔗渣廢棄物為原料以發酵生產- -聚麩氨酸之研究聚麩氨酸之研究 37 酸、131、20 min、固液比 1:50 處理後接入 1%纖維水解酵素、pH 4.5，在 50，100 rpm 進行水解反應。 （三三）菌株培養基與培養方法菌株培養基與培養方法 將菌株 B. subtilis D1 以劃線培養的方式接種於固態培養基（含洋菜 15 g/L、酵母萃取物 1.5 g/L、牛肉萃取物 15 g/L、NaCl 5 g/L）上，置於恆溫培養箱中（37、pH 7.4） 培養過夜 。以白金耳取一些菌體並置於不含洋菜之液態培養基（含酵母萃取物 1.5 g/L、牛肉萃取物
16、 15 g/L、NaCl 5 g/L） 中，並於 37培養箱中，150 rpm 震盪作前培養 48 小時。以 5%（v/v）前培養液置入於下述之生產培養基，再將接種後之生產培養基置於恆溫震盪培養箱進行恆溫震盪培養 （37、pH 6.5、150 rpm） 48。培養期間不定時取少量培養液並以下述方法分析菌體濃度 、 碳源濃度及-PGA 之濃度 。 （四四）碳源種類對聚麩氨酸生產之影響碳源種類對聚麩氨酸生產之影響 為探討菌株能否使用其他生質水解液為碳源，因此先探討 B. licheniformis CCRC12826（現為 B. licheniformis BCRC12826）及 B. subtilis D1 菌株能否使用不同單糖為碳源以生產聚麩氨酸。將聚麩氨酸生產菌培養於上述固態培養基與液態培養基，活化後再接種於 ME 8（Medium 8 培
