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1、中华老年多器官疾病杂志2 0 1 4年 1 月 2 8日 第 l 3卷 第 1 期C h i n J Mu l t O r g a n Di s E l d e r l y ， V o 1 1 3 ， N o 1 ， J a n 2 8 ， 2 0 1 4 5 9 基础研究 4 , 4 二异硫氰基芪 2 ， 2 一 二磺酸对高糖诱导心肌细胞损伤的保护作用 郭筱王，王 琳，沈明志，程 珂，杨 磊，何晓乐，王晓明 ( 第 四军 医大学西京医院老年病科 ，西安 7 1 0 0 3 2 ) 【 摘要】目的 探讨高糖诱导心肌细胞损伤过程中 氯离子浓度的变化以及氯离子通道阻断剂4 ，4 一 二异硫氰基芪
2、2 ，2 - 二磺酸 ( DI DS)对受损心肌细胞的作用 。方法 原代培养乳鼠心肌细胞 ，应用葡萄糖浓度为3 3 mmo l L D ME M培养基 ， 作用7 2 h ，构建心肌细胞损伤模型。实验分为对照组 、高糖组 、高糖+ D I DS 组和D I DS 组。用MT T 法检测细胞存活率 ， 流式细胞仪检测细胞凋亡率 ，氯离子荧光探针 ( MQ A E) 检测细胞内氯离子浓度。结果 高糖作用下的心肌细胞存活 率呈浓度及时间依赖性降低 ( PO 0 5 o与高糖组比较 ，高糖+ D I DS 组心肌细胞存活率显著升高 ，细胞内氯离子浓度 下降明显减少 ，差异均有统计学意义 ( P0 0
3、5 ) Wh i l e ，D I DS t r e a t me n t i m p r o v e d t h e c a r d i o m y o c y t e v i a b i l i t y a n d a a e n u a t e d t h e d e c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r C 1 一 i n c a r d i o m y o c y t e s a ft e r h i g h g l u c o s e i n d u c t i o n 0 0 5 ) C o n c l u s i o n C 1 i
4、 s i n v o l v e d i n t h e h i g h g l u c o s e - i n d u c e d c a r d i o my o c y t e i n j u r y D I DS a t t e n u a t e s t h e i nj u r y wh i c h ma i n l y p r e s e n t s a s a p o p t o s i s 【 Ke y wo r d s 】 h i g h g l u c o s e ； c a r d i o my o c y t e s ； a p o p t o s i s ； c h
5、 l o r i d e i o n i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e Na t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e Fo u n d a t i o n o f C h i n a f 8 1 2 7 0 1 6 9 ) C o r r e s p o n d i n g a u t h o r ：W A NG X i a o - Mi n g , E m a i l ： x m wa n g f mmu e d u c n 糖尿病 的心血管并发症已成为糖尿病患者死亡 的主要原 因【 ” 。 目
6、前研究认为其主要致病机制是高 糖激活了以活性氧 ( r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ，R OS ) 为核心的线粒体途径及 内质网应激途径等介导的心 收稿 日期 ：2 0 1 3 一 l 1 -1 3 ；修 回 日期 ： 2 0 1 3 1 2 2 7 基 金项 目：国家 自然科学基 金( 8 1 2 7 0 1 6 9 ) 通信 作者：王 晓明， E ma i l ： x mw a n g f mm u e d u c a 肌及血管内皮细胞损伤 。高糖在糖尿病心血管损 伤 中起到了重要作用 引 。氯离子是机体 内最丰富的 阴离子 。心肌细胞膜
7、和细胞器的氯离子通道在调节 p H、细胞容积及渗透压等方面发挥重要作用，并与 6 0 中华老年多器官疾病杂志2 0 1 4年 1 月 2 8日 第 1 3 卷 第 1 期C h i n J Mu l t O r g a n D i s E l d e r l y ， V o 1 1 3 ， N o 1 ， J a n 2 8 ， 2 0 1 4 细胞迁移 、增殖 、分化及凋亡等密切相关 4 】 。研究 发现 ，氯离子通道阻断剂4 ， 4 一 二异硫氰基芪 2 ， 2 二磺 酸 ( 4 ， 4 一 d i i s o t h i o c y a n o s t i l b e n e 2 ， 2
8、 d i s u l f o n i c a c i d ，D I DS) 能有效抑制死亡受体 、线粒体和 内质 网应激途径诱导的细胞凋亡 ， 挽救受损细胞 5 一 。 然 而 ，氯 离子通道 是否也参 与了高糖诱 导的心肌细 胞损伤 ，阻断该 通道 对高糖诱导 的心肌损伤有何 影响 ， 目前 尚不清楚 。本实验拟在高糖诱 导的心 肌细胞损伤模型基础上 ，通过观察细胞 内氯离子 浓度及细胞存活率 ，探讨DI DS 在高糖诱导心肌细 胞损伤中的作用 。 1 4 MT T 法检 测心肌 细胞 存 活率 将 心肌细胞 以5 1 0 5 ml 的浓度接种 于9 6 孔板 中 ，每孔 1 0 0 1 x
9、 l 。按所需实验条件处理后 ，吸弃培 养基 ，加 1 0 0 t l 无血清培养基及 l O t l 浓 度为5 g L 的 MT T溶 液 ，继 续 孵 育 4 h 后 取 出 ，每 孔 加 1 5 0 t l DMS O，振荡 1 0 mi n 。选择4 9 0 n m波长 ，在酶联免疫 检测仪上测定各孔光吸收度 ( A) 值 ( 值与活细胞 数呈正 比 )，以无细胞只J J I D MS O的调零孔测得 的 值为本底 值 ， 计算细胞存活率。 细胞存活率 ：( 实 验组 值 一本底 值 ) ( 对 照组 值 一本底 值 ) 1 0 0 。实 验 至少 重复 3 次 。 1 材料与方法
10、1 5 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡 1 1 实验动 物 与试剂 0 3 d 新生S D仔大鼠， 由第四军医大学实验动物中 心提供。D ME M培养基、胎牛血清由美 H y c l o n e 公司 提供 ；D 葡 萄糖 由V E T E C 公 司提供 ，D 一 甘露醇 由 S o l a r b i o 公司提供 ；D I DS 、 I 型胶原酶、胰蛋白酶、5 溴 2 一 脱氧核苷尿嘧啶 ( B r d U)、噻唑蓝 ( MT T)、二 甲基亚砜 ( DMS O)及A n n e x i n V F I T C P I 双染法细胞 凋亡检测试剂盒由美国S m 司提供 ；氯离子荧光探 针 f
11、N 一( e t h o x y c a r b o n y l m e t h y 1 ) 6 - me t h o x y q u i n o l i n i u m b r o m i d e ，MQ A E 由美国I n v i t r o g e n 公司提供。 1 2 原代乳鼠心肌 细胞培养 7 0 乙醇消毒乳鼠，于剑突下剪开胸腔 ，取 出 心脏 ，冰P BS 清洗3 遍 ，去除大血管和血污。将心脏 置于小烧杯 中，剪碎组织 。用 I 型胶原酶分6 8 次 将组织消化完全。收集上清液 ，加入等体积含血清 的D ME M培养基以终止消化 ，1 0 0 0 r mi n 离4 ) 5
12、mi n ， 弃上清。重悬细胞 ， 2 0 0 目细胞筛过滤细胞悬液 ， 接 种于细胞培养瓶 中 ，差速贴壁 l h 。加入终浓度 为 1 0 0 t mo l L 的B r d UI)A抑制成纤维细胞生长。5 C O 2 细胞培养箱3 7 孵育2 4 h 后 ，更换含B r d U的D ME M 培养基继续孵育4 8 h ，备用 。 1 3 实验分 组 与药物 处理 原代培养的心肌细胞随机分为对照组 、 高糖组 、 高糖 +D I D S 组及D I DS 组。 各组处理 ： 对照组采用含 血清DME M培养基( 5 5 mmo l L 葡萄糖 +2 7 5 mmo l L 甘 露 醇 )
13、；高 糖 组 采 用 含 血 清 D ME M培 养 基 ( 3 3 mmo l L 葡萄糖 )；高糖 +DI DS 组采用含血清 D ME M 培 养 基(3 3 m mo l L葡 萄 糖 ) +DI DS (1 0 0 t mo l L)；DI D S 组采用含血清D ME M培养基 ( 5 5 mmo l L 葡 萄糖+ 2 7 5 mmo l L 甘 露醇 ) +DI DS ( 1 0 0 t mo l L)分别培养。 参照A n n e x i n V F I T C P I 双染法细胞凋亡检测试 剂盒说 明进行试验。各组心肌细胞按实验条件处理 后 ，用0 2 5 胰蛋白酶消化细胞
14、 ，每组约收集1 1 0 。 个细胞 ，将消化的细胞用P B S，1 0 0 0 r mi n 离心洗涤 5 mi n ，洗涤离心后 ，弃掉P B S ，用2 5 ml 带血清培养 基重悬细胞 ，A n n e x i n V F I T C P I 染色，流式细胞仪 检测 ，分析细胞凋亡情况。结果判定 ：左下象限为 正常细胞 ，右下象限为早期凋亡细胞 ，右上象限为 晚期凋亡细胞 ，左上象限为死细胞。 1 6 MQA E 检 测 细胞 内氯 离子 浓度 将心肌细胞接种于4 8 T L 板中 ， 并按所需 实验条 件处理细胞 。用K r e b s HE P E S 缓 冲液将MQA E I 制
15、 成 浓 度 为 1 0 mmo l L的工 作 液 ， 每 孑 L 加 入 1 O 0 1a l MQ AE S 2 作液 ，5 C O2 细胞培养箱3 7 孵育1 h ，随 后用Kr e b s HE P E S 缓 冲液洗 涤5 次 ，每次5 mi n 。倒 置荧光显微镜进行荧光检测 ，并拍摄荧光照片 。每 组随机选 取5 个细胞 ，用I ma g e J 软件分析每个细胞 的荧光 强 度 。 1 7 统计学处理 采用G r a p h P a d P r i s m5 0 统计软件进行处理。实 验 数 据 以 表 示 ，多 组 间 比较 采 用 o n e w a y A NO VA 分析 ， 两组间比较采用L S D t 检验。P0 0 5 为差异有统计学意义。 2 结 果 2 1 高糖对心肌细胞存活率的影响 正常葡萄糖浓度 ( 5 5 mmo l L) 心肌细胞存活率 定义为1 0 0 。MT T 结果显示 ，经葡萄糖浓度分别为 5 5 ，1 1 ，2 2 ，3 3 ，4 4 mmo l L 的D
