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1、广 西 医学 2 0 1 4年 2月第 3 6卷第 2期 骨髓问充质干细胞移植抗大鼠肝纤维化的作用及机制 陶 霖姜海行覃山羽 金群馨 黄 雪 郭晓云谭至柔唐国都 ( 广西医科大学第一附属医院消化内科 ， 南宁市5 3 0 0 2 1 ， E m a il ： 7 5 7 4 3 0 2 6 7 q q c o rn) 1 41 【 摘要】 目的探讨骨髓间充质干细胞( M S C s ) 移植对大鼠肝纤维化模型的作用与机制。方法 分离大 鼠M S C s 培养传代至第4 代。采用大鼠腹腔注射四氯化碳制造肝纤维模型。将造模成功 s D大鼠6 0只， 随机 分为 3组 ， 每组 2 O只： ( 1
2、) 对照组 ： 鼠尾静脉 注射等量 的生理盐水 ； ( 2 ) MS C s组 ： 鼠尾 静脉 注射 MS C s悬液 ； ( 3 ) 诱导组： 鼠尾静脉注射经肝细胞生长因子( H G F ) 诱导 1 4 d 后的M S C s 悬液。于移植后第 l 周、 2周、 3周、 4 周分别处死大鼠5只， 检测大鼠血清透明质酸( H A ) 、 层黏蛋白( L N ) 、 I V 型胶原水平； 光镜下观察肝组织纤维化 程度； 分别用 P C R法及 We s t e rn检测大鼠肝脏 C o l I 、 R h o A 、 C d c 4 2 、 R a c 1 m R N A基因及其蛋白质表达水平
3、。结 果( 1 ) 诱导组与 M S C s 组的纤维化程度评分随着时间延长逐渐下降， 且在第4周诱导组评分明显低于 M S C s 组( P 0 0 5 ) ； 移植 2 周后， 诱导组血清 H A低于对照组L N 、 C o l - 1 V 低于 M S C s 组( P 0 0 5 ) ； 移植 2周后 ， 诱导组血清 H A低于对照组 ( P 0 0 5 ) ， 说明 H A是最敏感的血清学指标 ， 肝组织 的 H A、 L N、 1 V 型胶原含量 2周下降约 2 0 ， 而4周下降约 7 0 ， 且 H G F 诱导 M S C s 移植后肝组织的 H A ， L N ， IV型胶
4、原含 量下降更明显，2周下降与 M S C s 移植相似， 但4周下降 约8 0 ， 与 S a k a i d a 等 的报告类似。提示 M S C s 可以 抑制肝纤维化， 而经 H G F诱导 M S C s 后可以显著抑制 肝纤维化。 目前在人类细胞 当中发现至少 2 2种 R h o蛋 白， R h o 家族蛋白及其众多的效应因子不仅通过细胞骨架 而且通过其他细胞内的信号途径发挥广泛的生物效 应 - 1 1 1 。R h o A、 R a c l和 C d c 4 2是 目前研究最多的 R h o 家族成员， 在细胞迁移研究最广泛。在 R h o R O C K信 号转导通路 中，
5、虽然 R O C K只是 R h o G T P酶众多靶蛋 白 中的一种， 但由于 R h o G T P酶作为“ 分子开关” 可通过 多重级联反应与其他信号通路的“ 交谈” 及信号转导正 反馈作用而发生效应并通过其下游通路介导多种信号 转导 ， 产生多种细胞效 应。大量研究证实肝纤维化过 程伴随R h o 信号通路的激活与上调， R h o 信号通路可能 与其他纤维化细胞内或细胞外信息传递的上游因子， 阻断或抑制 R h o K i n a s e 能有效减缓乃至逆转许多组织 的纤维化发展进程 。本研究发现 M S C s 移植后大 鼠的肝纤维化好转之前已有 R h o 因子表达下调， 移植
6、 1 周后， 诱导组 C d c 4 2与对照组 比较 ， 差异有统计学意义 ( P 0 0 5 ) ； 移植 2周后 ， R h o A、 C d c 4 2首先出现 m R N A 或蛋白表达下调， 第 3 周 C o l - I 表达量才出现变化， 移植 3 周， 4 周后， 诱导组、 M S C s 组与对照组比较各指标比较 均明显下降( P 0 0 1 或 P o _ 0 5 ) ， 提示 M S C s 具有类 似 R h o 信号抑制剂的作用， 这种通过抑制 R h o 信号通 路抗纤维化的机制， 为进一步研究 M S C s 作用机制提供 了新的依据。 既往研究证实， M S
7、C s 可降低 C C 1 诱导肝纤维化 小鼠中肝纤维程度， 但 O y a q i 等 认为， 单纯 M S C s 移 鲎 2 0 1 4 年2月第3 6 卷第2 期 植不能减轻纤维化， 只有与 H G F共培养的 M S C才有 改善纤维化的作用。H G F在各种表达 c M e t 受体的 非肝样细胞具有多种功能， 研究证实 H G F可以抑制 肝细胞死亡和肝纤维化 1 。本研究表 明， 经 H G F诱 导后的 M S C s 具有肝样细胞功能， 能更快更好地修复 肝纤维化组织形态和功能。可能原因有 ： ( 1 ) H G F诱 导 M S C s 后， 虽然不具备全部肝脏细胞的功能
8、， 但其已 经进人了肝系细胞分化的阶段， 我们前期实验口 引 证 实骨髓干细胞 经过 H G F诱导 ， 肝细胞标志物 甲胎蛋 白、 细胞角蛋白1 8 、 白蛋白、 糖原表达与肝细胞发育成 熟过程吻合， 说明 H G F能在体外诱导骨髓干细胞向 肝样细胞分化并促进其成熟， 在肝脏损伤的微环境中 可能增殖， 进一步分化， 这些细胞行使部分肝细胞的 功能， 从而使损伤肝脏得到修复； ( 2 ) 此类细胞移植 后， 可能通过旁分泌诱导相关细胞分泌生长因子， 这 些生长因子有可能激活了肝脏的内源性干细胞， 使损 伤肝脏得到进一步的修复； ( 3 ) 在肝损伤时， 体内微环 境中所产生的细胞因子或应激信
9、号分子刺激或诱导 骨髓 M S C s 迁移至肝脏， 转化为肝细胞或肝细胞样细 胞而行使正常肝细胞的功能。未诱导 M S C s 的实验组 大鼠肝脏修复所需时间较长， 可能与以下机制有关： ( 1 ) 未诱导 MS C s 受细胞 因子或者趋化 因子介导 的定 向趋化能力较弱， 不能大量进入损伤肝脏定植生长； ( 2 ) 未诱导 M S C s 仍属幼稚干细胞， 未进入分化程序， 发挥作用较弱； ( 3 ) 未诱导 M S C s 在肝损伤微环境中 定向分化为肝细胞的能力较弱， 部分分化为胆管上皮 细胞和血管内皮细胞， 恢复肝功能作用有限； ( 4 ) 未诱 导 M S C s 不能直接激活内
10、源性肝脏细胞或者肝脏前体 细胞， 无法达到满意的修复程度。 综上所述 ， 大鼠外周静脉输注 MS C s 能促进 四氯 化碳致肝纤维化大 鼠模型 的修复过程， H G F诱导 MS C s 后 ， MS C s 发生形 态及功能改变 ， 对抗 肝纤 维化 作用增强， 这种修复过程涉及 R h o 信号传导通路的抑 制， 可能是 M S C s 抗肝纤维化的机制之一。 参考文献 1 L a g a s s e E， C o n n o r s H， A 1 一 D h a l i m y M， e t a 1 P u ri fi e d h e m a - t o p o i e t i c s
11、 t e m c e l l s C a l l d i ff e r e n t i a t e i n t o h e p a t o c y t e s i n v i v o J N a t Me d ， 2 0 0 0 ， 6 ( 1 1 ) ： 1 2 2 91 2 3 4 2 S a k a i d a I ， T e r a j S ， Y a m a mo t o N， e t a 1 T r a n s p l a n t a t i o n o f b o n e ran T o w c e l l s r e d u c e s CC 1 4 i n d u c e d
12、 l i v e r fi b r o s i s i n mi c e J H e p a t o l o g y ， 2 0 0 4 ， 4 0 ( 6 ) ： 1 3 0 41 3 1 1 3 O y a g i s ， I -I i r o s e M， I j i m a M， e t a 1 T h e r a p e u t i c e ff e c t o f t r a n 8 - p l a n t i n g HG F -t r e a t e d b o n e ma l T o w me s e n c h y ma l e e l s i n t o C C 14
13、一 i n j u r e d r s J J H e p a t o l ， 2 O O 6 ， 4 4 ( 4 ) ： 7 4 2 7 4 8 1 45 4 E s c h J S ， K n o e f e l WT ， K l e i n M， e t a1 P o r t a l a p p l i c a ti o n o f a u t o l o g o u s CD1 3 3+ b o n e ma n o w e e H s t o t h e h v e r ： a n o v e l c o n c e p t t o s u p p o h e p a t i c r
14、 e g e n e r a t i o n J S t e m C e l l s ， 2 0 0 5 ， 2 3 ( 4 ) ： 4 6 3 4 7 0 5 B r u n t E M G r a d i n g and s t a g i n g the h i s t o p a t h o l o g i c al l e s i o n o f c h r o n i c h e p a t i t i s ： t h e Kn o d e l h i s t o l o g y a c ti v i t y i n d e x and b e y o n d J H e p a
15、t o l o g y ， 2 0 0 0 ， 3 1 ( 1 ) ： 2 4 1 2 4 6 6 A b d e l A z i z MT ， A t t a H M， Ma h f o u z S ， e t a1 T h e r a p e u t i c p o t e n t i a l o f b o n e ma rro w d e riv e d me s e n c h y mal s t e m c e U s o n e x p e ri m e n t a l l i v e r fi b r o s i s J C l i n B i o c h e m， 2 0 0 7 ， 4 0 ( 1 2 ) ： 8 9 3 8 9 9 7 杨开选， 程薇波， 王冬文， 等 4 0 四氯化碳大鼠慢性肝损 伤模型的研究 J 现代预防医学， 2 0 0 5 ， 3 2 ( 1 ) ： 2 0- 2 1 8 S a k a i d a I ， T e r a i S ， Y a m a m o t o N， e t a 1 T r ans p l a n t a t i o
