《何首乌有效成分二苯乙烯苷对Aβ25-31诱导神经干细胞定向分化的影响 (论文)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《何首乌有效成分二苯乙烯苷对Aβ25-31诱导神经干细胞定向分化的影响 (论文)（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中医杂志 2 0 1 4 年2 月第5 5卷第4期J o u r n a l o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e ， 2 0 1 4 ， V o 1 5 5 ， N o 4 3 2 3 D O I ： 1 0 1 3 2 8 8 j 1 1 - 2 1 6 6 r 2 0 1 4 0 4 0 1 6 何首乌有效成分二苯 乙烯苷对 A I3 2 5 诱导 神经干细胞定 向分化 的影响 张玉莲 ，周 震 ，韩文文 ，宋宛珊 ，黄建华 ，张琳琳。 实验 研 究 ( 1 天津中医药大学第二附属医院，天津市河北区真理道 8 1
2、6号，3 0 0 1 5 0 ；2 天津中医药大学； 3 复旦大学附属华山医院) 基金项目：国家重点基础研究发展计划 ( “ 9 7 3 ”计划)资助项 目 ( 2 0 1 0 C B 5 3 0 4 0 5 ) 摘要 目的 探 讨 何 首乌 有 效成 分 二 苯 乙烯 苷 ( T S G) 对 13 一 淀粉 样 肽 ( A t 3 ) 诱 导神 经 干 细胞 ( N S C s )定向分化的影响。 方法从孕 1 4 d昆明小鼠体外提取并培养 N S C s ，分别建立起两组分化系统可溶 性 A t 3 体 外诱 导 N S C s损 伤 的 阿 尔 茨海 默病( A D) 细胞模 型：神
3、经元 细胞 分 化模 型 M1 ( A p 2 5 tx m o l L ) 、星形胶 质细胞分化模 型 M2 ( A t 3 5 I m o l L) 。T S G低、 中、高剂 量组 ( T S G浓度分 别为 l 0、1 0、1 0 m o l L )分别干预模型 M1和模 型 M 2，采 用 WS T 1细胞增殖及细胞毒性试剂盒检测各组 N S C s 细胞活性，采用免疫荧光法及蛋白印迹法观察各组 G F A P 、T u b u l in阳性细胞率及其蛋白表达情况。 结 果 模型 M1组和模型 M 2组细胞活性 A值较相应的对照组明显降低 ( P9 9 ，批号 ：1 0 9 0 1
4、0 ，购 自上海 友思生物技术有 限公 司) ，单体溶 于 D MS O溶液 ， 配制成 1 0 m o L L母液，用基础培养基稀释成所需 浓度 。参 照 L 6 p e z T o l e d a n o MA等 方 法 将 5 m g A 3 2 5 ( A n a S p a c ，批号：C A 9 4 5 5 5 )溶于 1 8 8 8 I x l 的双 蒸 水 中，震 荡 混 匀 ，过 滤 ，配 制 成 浓 度 为 2 5 mm o l L的母 液 ，用基 础培 养基分别将 其稀 释 成 终 浓 度 为1 z mo l L 、5 I x mo l L 、2 5 p mo l L ，
5、 一2 0 保存 。 1 3 试 剂 细胞 培养 基 K n o c k O u t D M E M F 1 2 ( G i b c o公 中医杂志2 0 1 4 年2 月第5 5 卷第4 期 J o u r n a l o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e ， 2 0 1 4 ， V o 1 5 5 ， N o 4 司 ，批 号 ：1 2 6 6 0 - 0 1 2 ) 、胎 牛 血 清( F B S ，G i b c o 公 司，批 号 ：1 0 0 9 9 1 4 1 ) 、表 皮生长 因子 ( E G F ， G
6、 i b c o 公司 ，批号 ：P H G 0 3 1 4 ) 、成纤维细胞生长因 子 ( b F G F ，G i b c o 公 司 ，批号 ：P HG O 0 2 4) 、S t e m P r o( r )N e u r a l s u p p l e m e n t 添加剂 ( G i b e o公司，批 号 ：A1 0 5 0 8 -01 ) 、青- 链霉 素溶 液 ( B i o w e s t 公 司， 批 号 ：H ) 0 2 2 1 0 0) 、A n t i G F A P ( Mi l l i p o r e公 司 ， 批号 ：A B 5 8 0 4 ) 、A n t
7、 i T u b u l i n b e t a l I I i s o f o r m ( Mi l 1 i p o r e公 司，批 号 ：MA B 1 6 3 7) 、B A c t i n ( S a n t a C r u z 公 司，批号 ：s e - 4 7 7 7 8 ) 、H R P标记 山羊抗小 鼠 I g G ( H+L ) ( M R B i o t e c h公 司，批 号 ：MR MI O 0 ) 、HR P标记 山羊抗兔 I g G ( H+L ) ( MR B i o t e c h公司 ，批号 ：MR R 1 0 0 ) ，WS T - 1细胞增殖 及细胞 毒
8、性 检 测试 剂盒( B e y o t i me公 司，批 号 ： C 0 0 3 6 ) 、We s t e r n及 I P细胞 裂解液( B e y o t i m e公 司 ，批号：P O 0 1 3) 、免 疫荧 光 试 剂盒( B e y o t i me 公 司 ，批 号 ：P 0 0 9 8 、P 0 1 0 2 - P 0 1 0 6) 、S D S P A G E 凝 胶 配 制 试 剂 盒( B e y o t i m e 公 司， 批 号 ： P 0 0 1 2 A) 、B C A蛋 白浓度试剂盒 ( B e y o t i m e公 司， 批号 ：P 0 0 1 0
9、 ) 、超敏 E C L化学发光试剂盒 ( B e y o t i m e公司，批号 ：P 0 0 1 8 )等。 1 4主要仪 器 超净工作台 ( U S A，T h e r m o F i s h e r S c ie n t if i c ) ， C O 2 恒温培养箱 ( U S A，T h e mr o S c i e n t i fi c F o r m a ) ， 光学 显 微 镜( J a p a n ，O l y m p u s ) ，荧 光 显 微 镜 ( J a p a n ，N i k o n ) ，B i o t e k a Q u a n t型 全 自动 酶标 仪
10、( C h i n a ，上海坤肯生物化工有限公司) 。 2 方法 2 1 N S C s 培养 由孕 1 4d昆明小鼠两侧大脑皮层提取 N S C s 作 为原代细胞 ，采用无血 清 D ME M F 1 2培养基 ( 内 含 E G F 、b F G F 、N e u r a l s u p p l e m e n t 、青一 链 霉 素双 抗)进行常规细胞培养，待长成神经干细胞球后， 使用 A c c t t u a s e 酶进行消化传代，3 d 后纯化培养收 集神经干细胞球，吹打均匀后接种于多聚赖氨酸包 被的 6孔 板 中，加 入分 化 培养 基( D M E M F I 2 、 2
11、 s u p p l e m e n t 、1 胎 牛血清 、1 双抗 )使 其贴 壁分化。 2 2 模 型 制作 体外培养正常的 N S C s 为悬浮生长，3 5 d 后 由 于单 细 胞 克 隆 而 成 球 生 长 ，加 入 不 同 浓 度 ( I p m o l L，5 p m o l L ，2 5 b m o L L )A p 2 5 进 行干 颅，分别采用免疫荧光法与 We s t e r n B l o t 法检测星 形 胶 质 细 胞 特 异 性 标 志 物 胶 质 纤 维 酸 性 蛋 白 ( G F A P ) 、神 经 元 细胞 特 异 性 标 志 物 微 管 蛋 白 (
12、T u b u l i n )表达的变化 ，由此建立起两组分化系统 可溶性 A 13 ： 体 外诱导 N S C s损伤 的 A D细胞 模 型_ J ：神经元 细胞分化模 型 M1 ( A p 2 5 p mo l L ) ； 星形胶质细胞分化模型 M 2 ( A 13 5 i z mo l L ) 。 2 3 分 组及给 药 神经元 细胞分化：对照 1组 ( 等量培养 基 ) 、模型 M1组 ( A13 2 2 5 m o l L ) 、T S G低剂 量组( A p 2 5 _ 3 】 2 5 j x mo l L+T S G 1 0 m o l L ) 、T S G 中剂量 组 ( A
13、 p 2 5 _ 3 l 2 5 p , m o L+T S G 1 0 mo l L ) 、 T S G高剂量组 ( A p 3 I 2 5 Iz m o l L+T S G 1 0 m o l L ) ； 星形胶质细胞分化：对照 2组 ( 等量培养 基) 、模型 M2组 ( A 13 2 5 Ix mo l L ) 、T S G低剂量 组 ( A p 3 1 5 m o l L+T S G 1 0 m o l L) 、T S G 中 剂量组 ( A p 2 5 5 I m o l L+ T S G 1 0 mo l L ) 、T S G 高剂量 组 ( AB 2 5 - 3 1 5 z m
14、o l L+T S G 1 0 m o l L) 。 常规消化细胞，计数后分别以细胞密度 1 X 1 0 爪 m l( 每孔 1 0 0 I x 1 )接种 于 9 6孔 板 、2 X 1 0 个 m l ( 每孔 2 m 1 )接种于 6孔板 ，培养 2 4 h后用于实验。 2 4观察指标及方法 2 4 1 细胞活性检测 按照 WS T 1细胞增殖及细 胞毒性检测试剂盒 的要求 配制 WS T 一 1溶液 ，每孑 L 加入 1 O t x l ，3 7 、饱和湿度 、5 C O ： 孵育 3 h ，用 B i o t e k a Q u a n t 型全 自动酶标仪在 4 5 0 n m处i
15、贝 0 定各 组吸光度 ( A值 ) 。细胞增殖越多越快 ，则颜色越 深 ，A值越大。 2 4 2免疫 荧光 法检 测 G F A P 、T u b u l i n阳性 细胞 数 将 提 取 的 N S C s培养 2 4 h后 转移 至提 前 用 1 0 g ml 多聚赖氨酸包被过 的 9 6孔板 ，4 8 h后收 集细胞 。按 照 免 疫 荧 光 试 剂 盒要 求 ，每 孔 加 入 0 1 m l 固定 液 固定 1 5 m i n并 洗 涤 2次 后 ，加 入 0 1 m l 封 闭液封 闭 6 0 mi n ( 如果 背景较 高 ，可 以 4 封闭过夜 ) 。按照适 当比例用免疫染 色一抗稀 释液稀释一抗 ：G F A P ( 1：1 0 0 0 )0 1 m L L 、T u b u l i n( 1：4 0 0 )0 1 m l 孔 ，室温一抗孵育 1 h后洗 涤 3次 ( 5 mi n 次 ) 。如果结果 背景较高 ，可 以适 当延长洗涤时间并增加洗涤次数。按照适当比例用 免疫荧光染色二
