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1、 应用指南 28-9796-95 AABiacoreTM无标记相互作用分析采用BiacoreTM 4000进行片段库的筛选和鉴定在药物研发中越来越多的使用基于片段的药物设计方法用于鉴别合适的结构框架。目前已经证实无标记技术如 X线晶体学和核磁共振成像（NMR）技术可用于鉴别药物靶点的低亲和力片段复合物。由于其较低的靶蛋白消耗、高信息容量和高质量数据等优点，表面等离子共振 （SPR）生物传感器已经成为该领域具有吸引力的一项 技术。配备Biacore 4000 LMW扩展包的Biacore 4000系统可应对低毫摩尔分子亲和力水平和低分子量片段所带来的挑战。目前已发展的方法和评估工具可用于识别过当
2、量的粘性结合物，并自动检测非典型的结合行为，从而将研究重点快速集中到表现良好的候选分子上。这些分析可应用于筛选单个浓度或一系列浓度的单个样本。通过竞争性实验确认片段攻击的特异性。专门的亲和力筛选评 估工具简化了毫摩尔级分子水平的亲和力评估。拥有能够满足大多数片段库筛选要求的足够通量，Biacore4000配备了新的方法设计、数据评估性能以及增强性 的数据输入和输出功能，Biacore 4000已经成为基于片 段药物设计的一个潜在的重要工具。下面展示的范例说 明，将Biacore 4000用于片段筛选和亲和力评估可在一 定程度上改善片段的选择，从而显著提高随后的共结晶 的成功率。介绍基于片段的先
3、导设计在短时间内以及高通量筛选无助于识别小分子片段作为化学研发项目起始点的情况下，便 可以满足研发新药物的要求。这种方法提高了通过筛选 更小数量的复合物/片段（成千上万而不是几千）以尽 可能多得涵盖相对大部分化学空间的可能性。整合结构 和功能结合信息用于识别有应用前景的片段。准确且快速优先地对这些片段进行后续分析和开发是至关重要的。清除筛选 针对每个靶蛋白在整个片段库中进行结合片段快速筛选目的：去除那些潜在的可能干扰后续分析的片段 结合水平筛选 亲和力筛选 竞争性分析 单浓度筛选 目的：对选定片段进行快速优先基于系列浓度的稳定状态分析 目的：亲和力等级评定并验证在样本缓冲液中使用抑制剂 目的：
4、验证和结合位点定位图1. 采用Biacore 4000系统提供的三个主要工具进行片段筛选以便提 高筛选质量（阴影框内）和简化分析。竞争性分析可显著降低结果的 假阳性率，而利用软件中的一般功能即可轻易实现操作。尽管具有优势，但片段筛选依然面临诸多技术问题。许 多结构结合分析方法，如核磁共振成像NMR和X线晶体成像等需要消耗大量的靶蛋白。此外，通常呈现低亲和力的片段（0.1-10mM）需要较高的样品浓度以获得较高的结合位点占用率。在实际操作中，这就意味着在与亲和力相关的分析中，由于溶解度的限制可能被迫使用未 达到最佳标准浓度的片段。Biacore系统的优势是在提供足够通量的同时，仅消耗少 量的靶蛋
5、白和片段。然而，SPR技术基于质量变化，分子量较低的片段（相对分子量在80-300）产生的信号也会较弱。总的来说，片段具有非常快的结合速率和解离速率，从而导致呈现方形的传感图。这表明应该使用稳定状态的亲和力分析以明确亲和力的大小，因为在正常 情况下，动力学速率常数是无法解决的。小分子应用专题38为了应付这些挑战，Biacore 4000 LMW扩展包提供了三 种专门的软件工具用于片段和其他低分子量复合物的筛 选（图1）。清除筛选工具用于识别那些持续结合的有问题的片段，这些片段可能会降低后续样本的数据质量。 进行清除步骤之后，采用结合水平筛选对片段进行优先 的后续分析。单浓度的片段与多个固定蛋白
6、进行作用， 包括靶蛋白、空白对照和额外的对照靶蛋白。根据结合 强度以及通过传感图形状分析得到的结合情况，如次级 相互作用情况来选择有前景的结合片段。将优先考虑的 片段（或整个片段库）在一系列浓度样本中进行作用结 合，并通过亲和力稳定状态分析描述其结合特性，测定 用于评定亲和力和配体效率等级的解离平衡常数。在使 用非最佳标准浓度样本时，或在与感兴趣的靶位点无关 的次级结合等条件下允许采用特定合适算法进行评估。材料与方法采用包含1920个片段的内部的无偏重片段库，对能与酪氨酸激酶K1（相对分子量31900）结合的片段进行筛选。根据标准选取片段，这个标准类似与特别强调化学多样 性和分子可溶性的三条规
7、定。所选片段的分子量在100 Da到260Da之间，平均分子量为220Da。为了实现最大 的样本处理量，所有分析均在关注单个样本的试验安排下进行，而相同的配体则固定在四个流通池内（见图2）。采用氨基偶联的方法将靶蛋白固定在感应芯片CM5表面。分别在1号孔和2号孔固定高水平浓度和低水平浓度的K1 蛋白，而碳酸酐酶（CA）则固定在5号孔作为靶向对照蛋白。一个孔含未修饰CM-葡聚糖和另一个活化/失活孔 作为参照（图2）。在每个分析周期中注射四个不同的 样本，每个流通池一个样本。一般而言，片段与靶向分子结合较弱则说明片段从表面 完全解离的速率较快，没有必要进行恢复再生。使用 Biacore 4000低
8、分子量扩展包中的评估工具对所有筛选 进行评估。图图2 2. 片段库筛选时的靶配置。1Spot2345碳酸酐酶对照K1高水平K1低水平参照（未修饰的 CM葡聚糖）参照 （空白表面， 活化/失活）清除筛选采用相同的注射时间对所有的片段在最高浓度下进行筛 选，随后按计划用于后续分析（2mM）。分析缓冲液： 10mM HEPES/NaOH pH 7.40,150mM NaCl，0.05% P20表 面活性剂，5mM MgCl2，1mM DTT和2%DMSO。对结合 到固定的靶向激酶和碳酸酐酶（对照蛋白）上的片段同 时进行筛选，如图2所示。结合水平筛选清除筛选运行设计包含一个具有良好性能的活化位点抑 制
9、剂Inh1，作为阳性对照和缓冲液为阴性对照，其同样 可用于结合水平筛选的评估。评估内容包括减除参照、 溶剂校正和分子量调整。竞争性分析在存在潜在特异性位点竞争剂Inh2的情况下，对所有浓度足够高的样本和缓冲液重复进行结合水平筛选，以确 保整个分析过程中活化位点被完全阻断。亲和力筛选在结合水平筛选中所有孔采用相同的配置。在亲和力筛 选中，Inh1同时作为阳性对照和Rmax对照。采用2m（KD 20nM）的Inh1饱和浓度来确定Rmax值。每个样本 从2000uM浓度开始逐步对半稀释10次，形成11个浓度（2000、1000、500、250、125、63、31、16、8、4和 2uM）。每个样本包
10、括一个空白对照。结果与讨论清除筛选清除筛选的目的是为了识别那些有问题的片段，特别是“棘手”的复合物。这些片段具有明显的持续结合能力，而这可能会降低后续循环分析中的数据质量。对于清除筛选,评估无需对照样本、减除参照或溶剂校正，只需最简单的分析设置。在本研究中，所进行的清除筛选评估设定同样用于结合水平筛选的评估，而这种方法可被高质量的片段库所简化。在这1920个片段以外，有12个片段在浓度为2mM的条件下被确定为问题结合物（占0.6%）。这12个复合物都能发生一般的或靶向相关的持续性结合（图3）。而其中一半的持续性结合物是靶向依赖的，其他的则可以分为一般的持续性结合或葡聚糖结合。对于每个靶向蛋白，
11、软件的自动评估结果以散点图的形式表现，并在每个循环（n）基线响应和下一个循环（n+1）基线响应之间转变。正是以这种方式，n次循环中注射的样本在n+1次循环中仍然能持续结合，从而可以对其进行定量。定量值根据循环数作散点图。小分子应用专题39-1000300100200400500600700900800525456585105125基线差异【（循环数+1）-循环数】)响应(RU)循环数无残留结合的片段 总的残留结合片段 选择性的残留结合片段 A)图3图3. 本研究中来自一块芯片板（384个样本）的清除筛选结果：A图显示每个循环（n）基线响应和下一个循环（n+1）基线响应之间的差异。以这 种方式，
12、n次循环中注射的样本在n+1次循环中仍然能持续结合，从而可以对其进行定量。定量值根据循环数作散点图。在清除筛选结果中，蓝色 的数据点表示与K1选择性结合（持续结合）而与CA（碳酸酐酶）不结合的片段。红色数据点表示在向所有靶蛋白注射后持续信号升高的一般持续 结合片段。图B中的传感图代表图A（圆圈内的）中相应的蓝色样本数据，而图C中的传感图代表图A（矩形圈内的）中相应的红色样本数据。-2000100040020060080012001400-20608010002040120140160响应(RU)时间-5050250150350450-20608010002040120140160响应(RU)时
13、间K1 HighK1 LowCA参照BaselineBaselineK1 High K1 LowB)C)CA参照软件自动对样本分配不同的符号（图3）：红色方框表 示包含在评估中所有孔内总的残留的结合片段，蓝色方 框表示复合物中选择性残留结合的片段（如酪氨酸激酶K1或碳酸酐酶CA），而绿色方框代表无残留结合的片段。 残留结合的cut-off设定为10RU。虽然持续结合不会阻断我们所感兴趣的位点，正如不会 影响阳性对照的结合一样，但仍可能导致分析过程中的 偏移从而低估片段的结合水平，降低数据质量。问题片 段可能会降低片段的优先性，在实验顺序中排在持续结 合片段之后。因此对于后续分析有必要去除这些问
14、题片 段。结合水平筛选在基于片段的药物研发早期阶段，候选片段几乎不可能 通过单一的检测从简单结合的片段中可靠地识别出来。因此，设计结合水平筛选仅仅是为了后续工作选择一定 数量的片段而不是提供结合片段的安全识别。结合水平筛选过程支持对那些注射开始后立刻检测响应 水平即表现出最强结合能力的片段进行优先考虑。在早 期报告时间点提供有关结合水平的足够的测量数据，而 同时降低在注射过程中由于发生非特异性结合而无意中 使片段发生优先化的风险。这些片段复合物通常无序杂 乱的结合，且易于被软件所识别，并用结合行为标志物 进行标记。散点图中片段不同的结合行为用不同的颜色来标记：低 解离速率的样本用黄色标记，而速
15、率RRmax的样本用 青色标记，在结合过程中速率呈现一定斜率的用蓝色表 示，有多种结合行为的样本用红色表示。无结合行为的 样本则用绿点表示。根据结合水平对片段进行等级评定 确定那些潜在的具有强烈结合能力的片段，而结合行为 标记物可简化结合行为良好片段的识别过程。因此，结 合水平筛选可以为那些最有前景值得后续研究的片段的 优化提供足够多的帮助。自动设定cutoff选取10%的样本，且这些片段作为优先 考虑的。然而，为了获取10%具有正常结合行为或其他 结合水平的片段，cutoff可以相应的进行调整。为了获取关于位点特异性的更多信息，在存在位点特异 性竞争剂的情况下，在所有样本和缓冲液中进行竞争性
16、 试验，从而确保整个运行过程中活性位点被完全阻断。 将该运行结果的数据与无竞争剂存在情况下进行的实验 结果数据进行比较。Hits的初次筛选需要两个选择标准： 结合水平的差异应该在20RU和50RU之间，在存在竞争 剂的情况下，结合水平在10RU左右或更小（图5）。这 种分析设定非常有效，因为在存在竞争剂的情况下，所 有片段的结合都与靶蛋白的其他结合位点有关，而与研 究感兴趣的位点无关，在本研究中将其视为次要结合。小分子应用专题40-555153575951150102030405060708090100响应（RU）-5205010152530-1030405001020607080无结合行为的样本 多种结合行为的样本 速率RRmax结合行为的样本 低解离速率的样本 速率呈现坡度的样本调整的相对响应-发生结合早期-1040100203050607080-103040500102060低解离速率A)B)C)速率呈现坡度的样本（蓝色标记物）低解离速率的样本（黄色标记物）图4图4. 将384个片段(浓度2mM)对靶蛋白K1进行结合水平筛选。（A）分子量调整后
