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1、微生物学通报 FEB 20, 2012, 39(2): 219 225 Microbiology China 2012 by Institute of Microbiology, CAS 基金项目：国家自然科学基金项目(No. 30972637); 南方医科大学公卫学院院长基金项目(No. GW201101) *通讯作者：Tel: 86-20-61648723; : 收稿日期：2011-08-05; 接受日期：2011-09-30 研究报告 脑膜炎大肠杆菌 K1 株 ppk1 基因致病机制初探 彭亮1 赵铁1 罗文英1 付美芹1 曹虹1* 黄胜和2 (1. 南方医科大学 公共卫生与热带医学
2、学院微生物学系 广东 广州 510515) (2. 美国南加州大学 洛杉矶儿童医院 美国 洛杉矶 90027) 摘 要: 【目的】构建脑膜炎大肠杆菌 K1 (Escherichia coli, E. coli K1)株 E44 的聚磷酸盐激酶 1 (Polyphosphate kinase 1, PPK1)基因敲除株, 并对其生物学功能进行初步研究, 为明确 ppk1 基因在 E. coli K1 株致脑膜炎机制中的作用奠定基础。 【方法】利用自杀质粒pCVD442 及基因同源重组技术敲除 E. coli K1 株 E44 中的 ppk1 基因, 构建 ppk1 缺失突变株ppk1; 体外比较
3、野生株和突变株在低营养及氧化压力情况下的生存能力; 考察二者对人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells, HBMEC)的黏附能力; 通过测定乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase, LDH)释放活性, 比较野生株和突变株对HBMEC 的损伤效应。 【结果】PCR 及序列分析证实, 突变株缺失全长 ppk1 基因。与野生株 E44 相比, ppk1 突变株 ppk1 在低营养环境中和氧化刺激条件下的生存能力明显降低。相对于 E44, ppk1 对 HBMEC 的黏附能力减弱。与 HBMEC 孵育后, 突变株孵育组HB
4、MEC 的 LDH 释放活性明显低于野生株孵育组。 【结论】ppk1 对 E. coli K1 株 E44 在低营养环境中的生存、抵抗氧化压力, 以及黏附 HBMEC 和对细胞的毒性损伤有重要作用。 关键词: 聚磷酸盐激酶 1, 大肠杆菌 K1 株, 脑膜炎, 突变株 ppk1 gene relates with the pathogenesis of meningitis infected by E. coli K1 PENG Liang1 ZHAO Tie1 LUO Wen-Ying1 FU Mei-Qin1 CAO Hong1* HUANG Sheng-He2 (1. Departmen
5、t of Microbiology, School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong 510515, China) 220 微生物学通报 2012, Vol.39, No.2 http:/ (2. Saban Research Institute, Childrens Hospital Los Angeles, Los Angeles, CA 90027, USA) Abstract: Objective To construct the polyp
6、hosphate kinase 1 gene deletion mutant of Es- cherichia coli (E. coli) K1 strain E44 and explore the role of ppk1 in the pathopoiesis of men- ingitis E. coli K1. Methods The ppk1 gene was knocked out from the genome of E. coli K1 strain E44 by using suicide vetor pCVD442 and homologous recombination
7、, and the mutant was named ppk1. Then the survival ablities of E44 and ppk1 in poor nutrition condition and oxidative stress were examined. The ability of the mutant adhering to human brain microvas- cular endothelial cells (HBMEC) was also compared with that of the wild type. The cytoge- netic toxi
8、c effects induced by ppk1 and E44 were tested by using the lactic dehydrogenase testing kit. Results The ppk1 gene of the mutant had been knocked out and was confirmed by PCR and DNA sequencing. The ppk1 deletion mutant showed to be defective in adhesion abil- ity to HBMEC and survival abilities und
9、er poor nutrition condition and oxidative stress. The damaging effects of HBMEC induced by ppk1 were significantly less than that induced by E44. Conclusion The ppk1 gene plays an important role in E. coli K1 surviving in low nutri- tion and oxidative stress condition, adhering to HBMEC and inducing
10、 cell injury. Keywords: Polyphosphate kinase 1, Escherichia coli K1, Meningitis, Mutant 细菌性脑膜炎是中枢神经系统常见的、严重的感染性疾病, 尤其对于免疫系统尚不完善的新生儿来说, 发病率和死亡率都比较高。引发新生儿细菌性脑膜炎的常见病原菌有大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)、B 族溶血性链球菌、单核增多李斯特菌、变形杆菌、流感杆菌等。其中大肠杆菌是最常见的导致新生儿脑膜炎的革兰阴性菌, 且以有 Kl 荚膜多糖的 Kl 株占绝大多数。尽管针对脑膜炎已开展了许多研究, 但其具体的致
11、病机制仍有许多未知之处, 给 E. coli K1 引发的新生儿脑膜炎的治疗或者药物开发造成许多困难。 聚磷酸盐激酶 1 (Polyphosphate kinase 1, PPK1)是 E. coli 内一种与聚磷酸盐合成有关的激酶, 负责可逆性催化 ATP 脱磷酸残基生成 ADP及聚磷酸盐, 而聚磷酸盐是生物体内普遍存在的一种线性无机盐聚合体12。 PPK1 由 ppk1 基因编码。研究发现, ppk1 与一些细菌的毒力或者压力适应性相关。 E. coli K-12 株缺失 ppk1 基因后, 对温度、高渗等条件刺激的抵抗力下降3; 敲除绿脓杆菌 ppk1 基因后会导致细菌菌膜形成能力减弱4
12、; 伤寒沙门氏菌的 ppk1 缺失株对肠上皮细胞侵袭能力降低5。但 ppk1 在 E. coli K1 株致脑膜炎中的作用和机制并不清楚。本研究主要根据基因同源重组的原理, 利用自杀质粒构建 E. coli K1株的ppk1缺失株, 并对其功能进行初步探索, 为深入研究 E. coli K1 致脑膜炎的相关机制奠定基础。 1 材料与方法材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、质粒及细胞: RS218株(从临床新生儿脑膜炎患者脑脊液中分离的大肠杆菌K1株, E44为具有利福平抗性的RS218株6)、DH5和SM10 pir及自杀质粒pCVD442由本实验室保存; T载体购自大连TaKaRa公
13、司。人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells, HBMEC) 由美国约翰霍普金斯大学医学院Kwang Sik Kim教授惠赠。 彭亮等: 脑膜炎大肠杆菌 K1 株 ppk1 基因致病机制初探 221 http:/ 1.1.2 主要试剂和仪器: 限制性内切酶、DNA聚合酶、 T4 DNA 连接酶购于大连TaKaRa, 细菌全基因组提取试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA回收纯化试剂盒、DNA marker、琼脂糖购于广州东盛, 其余试剂为国产分析纯。胎牛血清、培养基DMEM和胰酶购于美国Hyclone。细胞培养箱, 德国Heraeus;
14、 酶标仪, 美国Bio-Rad; 分光光度计, 上海美谱达。 1.2 方法 1.2.1 ppk1基因敲除株的构建: 方法参考 文献7。根据已测定的E44染色体上的ppk1基因及其两侧的DNA序列, 设计合成2对引物PKE-S1、PKE-B1及PKE-B2、PKE-X2(表1), 以E44染色体为模板, 用PCR分别扩增ppk1基因两端1.14 kb的A片段和1.28 kb的B片段。PCR扩增条件为: 94 C 3 min; 94 C 30 s, 56 C 30 s, 72 C 90 s, 30个循环; 72 C 10 min。 将扩增得到的A、 B片段分别连接到pGEM-T载体上。利用共同的B
15、amH位点将两个片段连接起来成为AB片段(2.42 kb), 然后将其亚克隆至自杀质粒pCVD442中, 构建重组质粒pCVDPK1; 将其转化到自杀质粒允许宿主菌SM10 pir, 并根据接合性转导的原理将自杀质粒pCVDPK1从SM10 pir转到E44中, 通过氨苄敏感性及PCR方法筛选出ppk1基因缺失株(自杀质粒上携带的缺少ppk1的侧翼序列连接片段AB, 会与E44染色体发生同源重组, 替换掉E44 上的同源片段, 从而使ppk1被剔除), ppk1基因缺失株命名为ppk1。利用重组片段两端引物PKE-S1、PKE-X2以及ppk1上下游引物PKE5、PKE3进行敲除株的PCR鉴定, 并进行测序鉴定。 1.2.2 低营养条件下的生存能力比较: 将E44、ppk1按1:100比例加入含有100 mg/L利福平的Luria-Bertani (LB)液体培养基中, 37 C静置培养过夜。将培养过夜的细菌接种至低营养MOPS (Potassium morpholinopropane sulfonate, MOPS) 液体培养基8。从中取出1 mL菌液10 000 r/min离心2 min, 收集细菌并用PBS重悬。用无菌PBS将细菌洗3次后稀释1倍测OD600, 调OD600至约0.05, 并以之为始点, 每隔2 h测OD600值并
