《酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望摘 要：本文综述了酶抑制法测定食品中农药和重金属残留的原理，检测中常用的酶类、检测技术以及酶抑制法在实际应用过程中的问题。酶抑制法具有检测时间短、成本低、操作简便等特点，是目前我国农药残留及重金属检测的一种有效的初筛方法。关键词：酶抑制；农药残留；重金属；快速检测前言对日益严峻的全球化环境污染问题，环境工程技术与生物技术的结合发展，为环境保护污染治理提供了新的技术手段。传统的污染治理方法存在着诸多的自身缺陷。主要表现在：处理效率低下、占地广、浪费土地资源和能源、处理成本高、效果不尽理想、
2、容易产生新废弃副产物，甚至产生新的污染源。所以以环境生物技术为新技术体系解决环保污染成为当今乃至未来发展的方向。而酶与酶技术的开发与应用是环境生物技术中重要的部分。现代研究表明，酶与酶技术与环境保护的关系十分密切。酶与酶技术以实际应用的要求为目的，利用酶的催化特性对对象进行有用物质的生产或有害废物的分解。几年来，环保用酶制剂与酶技术已经开始引起学术界的关注。由于农药和化肥的滥用或使用不当，蔬菜中农药和重金属残留严重影响了人们的健康1。随着人们生活水平的提高和环境意识的不断加强，食品中农药和重金属残留问题越来越受到人们的关注。为了保障消费者的安全和健康，提高农产品的质量安全水平，增强农产品的国际
3、竞争力，我国政府决定加强蔬菜中农药和重金属残留的监控，建立健全农药及重金属残留的监测体系2。目前我国已经发展了很多切实可行的检测技术，其中，酶抑制技术具有快速、简便、灵敏及成本低等优点，深受广大基层监督部门、生产基地及市场的欢迎。1 酶抑制速测技术原理简介酶抑制法是一种简便、灵敏、经济的快速检测方法，目前在有些国家已经推广应用，在我国一些大城市，如北京、上海、南京、厦门等城市的蔬菜批发市场也建立了快速检测试验室。对上市的蔬菜进行粗筛，严禁农药和重金属残留明显超标的蔬菜销售。1.1 酶抑制法检测农药残留原理酶抑制法检测农药残留原理有机磷酸酯类（OPs） 、氨基甲酯类（CBs）和拟除虫菊酯类是我国
4、目前杀虫剂的三大支柱。其中，有机磷和氨基甲酸酯类占杀虫剂总量的 70 %以上3，也是对人畜毒性较强的两类杀虫剂，是目前蔬菜中农药残留的控制重点。有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂具有相同的作用靶标乙酰胆碱酯酶(AchE) 。它们抑制动物体内的乙酰胆碱酯酶(AchE) 的活性，从而导致神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常的神经传导，酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望甚至引起动物的中毒或死亡。根据这一昆虫毒理学原理，用在对农药残留检测中，通过测定蔬菜提取液对 AchE 的抑制之后，酶与底物结合状况，可以用来表征蔬菜提取液对酶活性的抑制作用，从而判断蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药是否超
5、标。酶抑制法通常是根据测定酶水解底物后产物的含量与标准品相比来进行定量测定，主要方法有以下 4 种：1）p H 法。测定底物水解后产生的乙酸；2）电位滴定法。将底物经水解后产生的乙酸进行电位滴定；3） 压力测定法。测定底物水解后的产物乙酸与碳酸氢钠反应所放出的 CO2气体压力；4）比色法。测定底物水解产物与显色剂反应后的颜色变化。以比色法为例，如果提取液中含有有机磷类或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就会被抑制，酶就无法水解底物，产生的水解产物就没有或很少，从而不显颜色或颜色变化很小。反之，如蔬菜提取液中无有机磷类或氨基甲酸酯类农药残留或很低，酶的活性就不会被抑制或抑制很少一部分，加入的底物就会被水
6、解，与显色剂反应就会产生颜色或随时间变化颜色变化较大。用分光光度计测定吸光值随时间变化，计算抑制度，就可以判断蔬菜中有机磷类或氨基甲酸酯类农药的残留情况。1.2 酶抑制法检测重金属原理酶抑制法检测重金属原理酶是维持生物体新陈代谢的重要催化剂，进入生物体内的重金属离子与体内某些酶的活性中心具有特别强的亲和力，使酶失去活性。酶抑制法测定重金属的基本原理就是进入生物体内的重金属离子与体内某些酶的活性中心具有特别强的亲和力，使酶失去活性。重金属离子与形成酶活性中心的巯基或甲巯基结合后，改变了酶活性中心的结构与性质，引起酶活力下降，从而使底物酶系统产生一系列变化，诸如使显色剂的颜色、pH、电导率和吸光度
7、等发生改变，这些现象可以直接用肉眼加以区别或通过电信号、光信号被检测到，这样就可以判断样品中是否有重金属存在4。2 检测用酶2.1 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7）是一种催化乙酰胆碱分解的水解酶，具有能被 OPs 和 CBs 类农药强烈抑制的特性。乙酰胆碱酯酶以多种分子形式存在，按其分子特征可分为球型（对称型）及尾型（不对称型） 。球型又可以分为两个亚类，即与膜结合的疏水性蛋白及可溶性蛋白。不同分子型一线胆碱酯酶具有相同的催化活性及 Km 值，但电泳迁移率及氨基酸组成有差别5。乙酰胆碱酯酶是多分子型糖蛋白，来源于不同
8、种属的乙酰胆碱酯酶其一级结构差异较大。不同生物来源和不同分子型的乙酰胆碱酯酶在结构上的差异，使得它们在被有机磷农药抑制方面有不同的选择性和灵敏度6。乙酰胆碱酯酶主要存在于神经元和神经肌肉接头处，为膜结合蛋白7，广泛存在于动物的组织、血液、昆虫组织及植物中。在生态毒理学研究中，常采酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望用双分子速率常数（Ki）来评价 AChE 对有机磷农药的敏感性。Ki 值越大，表明农药的抑制作用越强，或酶的敏感性越高。不同酶源对农药的 Ki 值存在很大差异，表明不同来源的乙酰胆碱酯酶存在敏感性差异。同种昆虫不同品系的 AChE 结构和性质有所不同，因此对不同杀虫
9、剂的敏感性也不同。无论采用何种检测方法，酶都是决定检测方法灵敏度和可靠性的最关键因子。使用高活性、高敏感性、性质稳定的乙酰胆碱酯酶不仅可以提高检测灵敏度，而且可提高检测的准确性，降低测定误差。2.2 植物酶植物酶利用有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的特异抑制作用发展的酶化学分析法，已广泛应用于痕量和微量有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的检测，但是乙酰胆碱酯酶来源于动物体，材料昂贵，且保存困难。近年来发展了用植物水解酶替代乙酰胆碱酯酶的分析方法8。该方法的原理是利用植物水解酶水解 2，6 - 二氯乙酰靛酚，根据反应溶液在水解前后颜色的变化，用眼睛或仪器辨别农药对酶的抑制程度。在有机磷或氨基甲酸酯类农药存在时
10、，植物水解酶的活性受抑制，靛酚的蓝色变浅。植物酶法在测定过程中无需使用有机溶剂，预处理方法简单，测定速度快，成本低廉，因此有推广应用的价值。2.3 脲酶脲酶土壤酶活性大小可以敏感地反映土壤重金属污染状况，许多学者先后提出了脲酶、蔗糖酶、磷酸酶等作为土壤污染水平的指标9，其中最为敏感的是脲酶( urease) 。脲酶广泛存在于自然界中，主要来源于豆类植物，如刀豆脲酶、黄豆脲酶等。脲酶可催化尿素水解，产生 CO2 和 NH3，反应速度比无脲酶催化快 104 倍10。当样品中存在重金属离子时，脲酶活性受到抑制，作为其分解产物的氨也相应减少。样品中的重金属离子对脲酶活性抑制率的高低，可以反映重金属离子
11、量的多少，根据指示剂颜色或反应液 pH 值的变化，就可以对样品中的重金属离子进行定性或半定量分析。和文祥等11通过对脲酶与 Hg2+、Cd2+间关系的研究，表明：不同状态脲酶对Hg2+、Cd2+的反应表现出类似的规律性变化，即 Hg2+、Cd2+抑制脲酶活性，其中Hg2+、Cd2+复合污染的影响幅度最大，Hg2+的生态毒性最强；相关分析显示脲酶活性均可表征样品 Hg2+、Cd2+污染的程度。2.4 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（GOD）是一种需氧脱氢酶，它能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。利用金属离子对葡萄糖氧化酶辣根过氧化物酶（POD）催化体系酶活的抑制作用检测重金属已见报道。刘
12、京萍等12利用葡萄糖氧化酶抑制法检测食品中镉、锡、铅的残留，对葡萄糖氧化酶过氧化物酶反应体系条件进行优化，选择 2，4-二氯酚为显色剂，做了温度、酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望试剂用量、反应时间等试验，确定了最佳反应条件；利用金属离子对酶活的抑制作用，测定了重金属离子镉、锡、铅对葡萄糖氧化酶活力的影响。所测 Cd2+、Sn2+、Pd2+检出限分别为 1.3、0.4、1.4 g/mL。2.5 磷酸酯酶磷酸酯酶磷酸酯酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。在许多生物体中都普遍存在的一种磷酸酶是碱性磷酸酶
13、。周礼恺13研究了不同用量重金属 Hg2+，Cd2+和 Pb2+对脲酶和磷酸酯酶等酶活性的影响，重金属对酶抑制作用顺序为 Hg2+Cd2+Pb2+，且随金属浓度的增大而增强。余寿娜等14研究了重金属 Cd2+、Hg2+复合污染对脲酶和酸性磷酸酶活性的影响。结果表明 Cd2+、Hg2+单一及复合污染都对脲酶和酸性磷酸酶的活性具有明显抑制作用，且随重金属浓度增强而增强（浓度1 mg/kgCd2+除外） 。与单一 Cd2+或 Hg2+污染相比，Cd2+和 Hg2+复合污染对脲酶和酸性磷酸酶活性的抑制作用均表现为一定的协同作用。除此之外，蛋白酶、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、转化酶、丁酰胆碱脂酶和异柠檬酸
14、脱氢酶等也可用于痕量重金属的测定。3 酶抑制检测技术3.1 农药残留酶抑制检测技术农药残留酶抑制检测技术农药残留酶抑制法检测方法主要包括：酶片法、比色法、胆碱酯酶生物传感器法。3.1.1 酶片法酶片法是将敏感生物的胆碱酯酶和乙酰胆碱类似物 2，6-二氯靛酚乙酸酯经固化处理后加载到滤纸片上，2，6-二氯靛酚乙酸酯在胆碱酯酶的催化作用下迅速分解，生成靛酚（蓝色）和乙酸。若样品中含有机磷和氨基甲酸酯类农药，胆碱酯酶活性被抑制，不发生水解反应，无蓝色物质生成。根据颜色变化可直接判断有机磷、氨基甲酸酯类农药是否存在，蓝色示农药残留，浅蓝色或白色示无农药残留。目前使用的农药速测卡和农药残留速测箱都属于酶片
15、法。3.1.2 比色法比色法是将待测样品提取液与敏感生物中提取的胆碱酯酶作用，以碘化硫代乙酰胆碱或碘化硫代丁酰胆碱等为底物，以 5，5-二硫代-2，2二硝基苯甲酸为显色剂，反应一定时间后，用分光光度计在波长 412 nm 处比色，根据吸光值变化计算胆碱酯酶抑制率，判断有机磷和氨基甲酸酯类农药残留是否超标。市场上使用的酶主要是以敏感家蝇头部提取纯化的乙酰胆碱酯酶（AChE）和从动物血清中提取的丁酰胆碱酯酶酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望（BuChE） 。农业部药检所提供的 BuChE 检测农药残留的方法己在各地推广使用，其测定时间为 40 min。3.1.3 胆碱酯酶生物传
16、感器法胆碱酯酶生物传感器是利用农药对靶标酶活性的抑制作用研制的生物传感器，它是将酶（如 AChE）固定在载体上，如将 AChE 固定在石英晶体表面，随着酶反应的速率和程度的改变，电流频率随着发生变化，通过测定电流频率判断 AChE 被抑制的程度。3.2 重金属酶抑制检测技术重金属酶抑制检测技术3.2.1 生物传感器法重金属含量酶抑制检测技术生物传感器法和胆碱酯酶生物传感器法原理相同，已有很多学者做了相关研究。Tadeusz 等15研制的酶传感器是将脲酶包埋在 pH 敏感铱氧化电极表面的 PVC 膜上构建而成的，通过将反应系统电势下降的初始速率（与酶初始反应速率成正比）转化为抑制率，来检测汞和其他重金属离子。不同形式的汞离子 Hg（NO3）2、HgCl2、PhHgCl、Hg2（NO3）2抑制效应不同，无机汞的检测范围可达 0.05 mol/L-1.0 mol/L。Compagnone16使用氧化酶传感器来测定重金属离子，发现 Hg2+对酶活性的抑制最为明显，尤其是甘油-3-磷酸氧化酶
