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1、遗遗传传学学实实验验指指导导山山东东农农业业大大学学遗遗传传学学教教研研室室二二 O OO O 五五年年目目 录录实验一 植物花粉母细胞减数分裂的染色体观察实验二 植物花粉母细胞减数分裂制片技术实验三 植物根尖压片技术实验四 染色体组型分析实验五 基因的分离、独立分配和互作实验六 连锁基因的遗传分析实验七 果蝇的形态鉴别和饲养管理实验八 辐射对植物染色体的诱变作用实验九 植物 DNA 的提取与定量分析实验十 植物的 RAPD 分析1实验一 植物花粉母细胞减数分裂的染色体观察一、实验原理减数分裂是性母细胞在分裂形成配子过程中一种特殊的细胞分裂方式。在这个过程中，染色体复制一次，细胞分裂两次，最终
2、形成的配子染色体数目比母细胞减少一半。雌雄配子受精结合后代又恢复正常的染色体数目，从而保持了物种在遗传上的稳定性；同时由于减数分裂中同源染色体的非姊妹染色单体的交换为后代的变异提供了基础。减数分裂包括减数第一次分裂和减数第二次分裂两个连续变化的阶段。每个阶段根据细胞和染色体的变化特点分为前期、中期、后期和末期四个时期。由于减数第一次分裂的前期较长，染色体变化也比较复杂，所以又常常将前期 I 分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变（浓缩）期。染色体是遗传物质的载体，在减数分裂中的行为对遗传物质的分配和重新组合具有重大影响，因此了解染色体在减数分裂中所表现的特殊变化，可以从细胞学水平加深对遗传学
3、基本规律的理解。本实验通过在光学显微镜下对供试材料永久制片的观察熟悉性母细胞和染色体在减数分裂过程中各个时期的变化特点，对减数分裂的具体过程和意义有深刻的了解。二、实验材料和实验用品玉米、小麦等花粉母细胞减数分裂的永久制片和照片，以及显微镜、擦镜纸等。三、实验内容与步骤利用玉米、小麦等花粉母细胞的减数分裂永久制片，参考减数分裂各个时期的显微照片，在显微镜下进行系统地观察，掌握各个时期的特点。减数分裂各个时期的主要特点简述如下：1前期 I（1）细线期：细胞核内开始出现细而长交织成一团的线状物，难以找到两端，无法计数，这是初期形成的染色体。核仁和核膜清晰可见。（2）偶线期：同源染色体配对联会形成“
4、二价体” 。由于此时每条染色体已经复制，因此每个二价体包含四条染色单体。由于同源染色体联会的行为在光学显微镜下看不到，并且这一时期时间较短，染色体又很细长，难以同细线期明显区分开来。这一时期核仁和核膜仍清晰可见。（3）粗线期：染色体进一步螺旋化呈粗线状。染色体的个体性逐渐明显。非姊妹染色单体之间的“交换”就发生在该时期，但“交换”的行为不能直接在显微镜下观察到。核仁和核膜在这一时期仍然可以看见。（4）双线期：染色体进一步缩短变粗，每个二价体的一对同源染色体相互排斥，并开始彼此分开。但由于非姊妹染色单体的交换，每个二价体出现了数目不定的交叉结使二价体仍然维持在一起而不完全分开。该时期核仁和核膜仍
5、然可见。2（5）终变期：染色体高度浓缩，交叉结端化，每个二价体只在末端相连，核仁和核膜仍然可见。此时所有二价体分散在整个核内，可以进行染色体计数，某生物有多少对染色体此时就有多少个二价体。2中期 I：核仁和核膜的消失，标志着前期的结束，中期的开始。此时，所有二价体排列在纺锤体的赤道面上。每个二价体两条染色体的着丝点分别趋向纺锤体的不同极。如果从纺锤体的一极向赤道面观察，仍可计数染色体。由于一对同源染色体两个成员的着丝点朝向细胞的哪一极完全是随机的，因此在不同性母细胞中，此期染色体的排列具有多种可能性。3后期 I：每个二价体的两条染色体都以着丝点为先导，由纺锤丝牵引分别向细胞的两极移动。结果细胞
6、的每一极只分到了一对同源染色体中的一条，从而使每一极分到的染色体数只有原来的一半。此时分到每一极的每条染色体的两条姊妹染色单体仍然由共同的着丝点连在一起。4末期 I：染色体到达细胞两极后，细胞的每一极又重新形成核膜和核仁，随之胞质分裂（有的植物此时胞质不分裂） ，形成两个子细胞，称为“二分子” 。减数第一次分裂结束后，经过一个短暂的间期，很快进入减数第二次分裂，第一次分裂是染色体数目减半的过程。5前期 II：细胞核内又重新出现染色体。每个染色体的两条姊妹染色单体仍由同一个着丝粒连在一起，但两臂已彼此分开。6中期 II：每个子细胞内的染色体都以自己的着丝点排列在细胞的赤道面上，染色单体的两臂自由
7、地散开。7后期 II：每条染色体的着丝点纵裂，两条姊妹染色单体在两极纺锤丝的牵引下，相背移向两极。8末期 II：染色体分到两极后，细胞的每一极又重新形成核仁和核膜，然后胞质分裂。整个减数分裂过程使原来的一个母细胞分裂成四个子细胞，每个子细胞内只含有母细胞染色体数目的一半。分裂刚完成时四个子细胞彼此靠在一起，称为“四分子” 。四、思考题1玉米的体细胞中有 10 对染色体，中期时可能的排列方式有多少种？2以玉米为例说明在减数分裂过程中，染色体数目怎样从 2n=20 变为 n=10。五、作业绘制减数分裂粗线期、终变期、中 I、后 I、中 II、后 II 的图像。3实验二 植物花粉母细胞减数分裂制片技
8、术一、实验原理减数分裂是生物在性母细胞成熟形成配子过程中发生的一种特殊有丝分裂，它包括连续两次的细胞分裂，第一次分裂是减数的，第二次是等数的。第一次分裂的前期较长，染色体变化较复杂，可细分为 5 个时期，即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。染色体在减数分裂的行为对遗传物质的分配和重组产生重大影响。高等植物在形成雄配子的过程中，花药内的小孢子母细胞（2n） ，经过减数分裂最终产生四个小孢子。每个小孢子内的染色体数目已减半为 n。以后每个小孢子进一步发育为花粉粒。由于植物花药取材容易，操作方便，一般作为减数分裂制片材料。在适宜的时期采集植物的花蕾，经固定液杀死固定，使细胞保持活体时形态。然后
9、进行压片染色等处理，制成减数分裂玻片标本，在显微镜下进行观察，可以看到小孢子母细胞的减数分裂过程（即染色体由双倍变为单倍体的过程） ，研究染色体在形态和数量上的动态变化特点。二、实验材料和实验用品1实验材料 玉米雄花序2实验用品显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、镊子、培养皿、酒精灯、吸水纸、纱布、刀片、滤纸、火柴、等。3实验药品无水乙醇、95%乙醇、重铬酸钾、浓盐酸、浓硫酸、冰醋酸、二甲苯、加拿大树胶和洋红（或苏木精） 。三、实验方法与步骤1取材：选取适当大小的花蕾，是观察花粉母细胞减数分裂的关键性步骤。不同植物取材时期不同。玉米：在抽雄前两周左右（大喇叭口期） ，用手指从喇叭口处向下挤捏叶鞘，
10、触到有松软感处，即是雄花序所在部位。在该处用刀片纵向划一切口，用镊子取出花序分枝。此时雄花序先端小穗颖长 4mm 左右，花药长 23mm，每一分枝中上部小穗发育最早。取材时间一般在上午 9 时10 时，不同材料间稍有差异。2固定：取下的材料应立即放入固定液中杀死固定。在 415条件下，一般固定时间为24 小时。固定后的材料先用 95%酒精漂洗至无醋酸气味，再移到 70%酒精中置于冰箱内保存。常用的固定液是法氏固定液，在使用这种固定液时应注意现配现用，固定时不要在阳光下暴晒。3染色和压片：先将已固定的材料置于培养皿内并倒入少许保存液。用镊子摘取一个适当大小的小穗或花蕾放在吸水纸上吸掉多余的酒精，
11、然后放在载玻片中央。用解剖针挑出 23 个4花药，并立即滴醋酸洋红或醋酸铁矾苏木精染色液于花药上。用解剖针将花药横向切断，并从一端向切口轻轻挤压花药，使花粉母细胞从切口处逸出。然后用镊子除尽花药壁等杂物。这是压片优劣的关键步骤之一，如不去净残渣，则不容易把分裂的细胞压平，使染色体不容易分散开，并且在制作永久片的过程中，细胞会从载玻片上大量脱落。去净残渣后，在低倍镜下进行初步镜检，如果花粉母细胞处于减数分裂时期，即可加上盖玻片。加盖玻片时，先使盖玻片的一边放在载玻片上，待染液布满整个边缘时，左手握镊子顶住盖玻片，右手握解剖针托住盖玻片轻轻放下。加上盖玻片以后，如有多余染色液，可用吸水纸吸去；如染
12、色液不能布满盖玻片，则在盖玻片一边稍加染色液，然后在酒精灯上烤片。烤片时，用手平持片子在酒精灯上方来回移动，并经常将片子放在手背上试温，以片子不烫手为宜，可反复进行多次。烤片是制片过程中的一项很重要的步骤。通过烤片可使细胞质颜色变浅，而染色体能得到充分鲜明的着色。烤片以后可在盖玻片上加一小块吸水纸，以拇指或用带橡皮头的铅笔轻压盖片。应注意不要使盖片移动。如果镜检发现染色体染色太浅，可在盖玻片周围稍加染色液再烤；如果染色太深，可从盖玻片一边滴加 45%冰醋酸，在另一边用吸水纸吸，让冰醋酸从盖玻片下流过直至细胞质颜色较浅而染色体着色明显清析为止。4制作永久片：要使片子能长期保存应用，可制成永久片。
13、永久片的制作主要包括分片、脱水透时和封片三个步骤。首先用培养皿（内置 U 型玻璃管或一根短玻棒）若干套编号，配制多级脱水剂（常用脱水剂见附录二） 。（1）分片：准备制成永久片，首先使其翻转让盖玻片朝下浸入第一级培养皿内分片。让载玻片的一端搭在短玻棒上，另一端和皿底接触，使盖玻片自然脱落，并标记载玻片和盖玻片原来相对应的方向和位置。（2）脱水透明：用一端劈开的去磷头火柴棒夹住盖玻片（方向不变，材料朝上） ，放入第二级培养皿中。而载玻片要翻转使有材料的一面朝上。然后依次逐级脱水，一般每级约 12 分钟。如用第三种脱水剂每级约 2030 秒钟。为了防止在脱水过程中细胞从片上脱落，在制片时可先在盖玻片
14、上涂一层蛋白甘油胶，在酒精灯上烘烤至冒出轻烟后，稍凉片刻盖在有材料的载玻片上。（3）封片：片子从最后一级培养皿内取出后稍凉，于载玻片上原来加盖玻片的位置中间滴一滴完整的加拿大树胶，然后翻转盖玻片（使有材料的一面朝下） ，按原来的方向和位置轻轻盖在树胶上。要使盖玻片随着胶的扩展自然下沉，不要施加压力或移动盖玻片。然后平放在阴凉处晾干再镜检。对于镜检符合要求的片子，在载玻片右端贴上标签，注明标本名称，制片日期。附冷冻分片法：这种方法快速简单。对准备制作永久片的玻片，先用液态二氧化碳干冰冷冻，或用冰冻致冷器进行冷冻，待完全冷冻结冰后，用刀片将盖玻片同载玻片分开，将载玻片和盖玻片放在 37左右的温箱内
15、烘干。取出后放在二甲苯内浸泡 1020 分钟，滴加树胶封片即可。四、作业和思考题1写出制片步骤流程图。52制作两张质量较好的临时片（有条件可制作永久片） ，并绘出自己所制作片子的分裂相，说明其时期和特点。6实验三 植物根尖压片技术一、实验原理有丝分裂是植物细胞分裂、体细胞增殖的主要方式，在有丝分裂过程中，细胞核内染色体准确地复制，并有规律地、均匀地分配到两个子细胞中，使子细胞和母细胞具有同样数目和形态结构的染色体，保证了植物细胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植物组织中，如根尖组织、茎尖组织、居间分生组织、愈伤组织等，细胞常进行着旺盛的有丝分裂。在细胞分裂的适当时期取材，通过对供试材料进行一定
16、的处理，就可以在显微镜下观察染色体的变化特点和染色体的形态特征，并进行染色体计数。由于在有丝分裂的中期染色体具有典型的形态特征，并易于计数，因此为了获得更多的中期染色体图像，可以采用药物处理或冰冻处理的方法，阻止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期。同时通过处理还可使染色体缩短，易于分散，便于进行观察研究。另外，通过对细胞组织进行酸性水解或酶处理除去细胞之间的果胶层，并软化细胞壁，使细胞容易彼此散开，有利于压片和染色。二、实验材料和实验用品1材料：圆葱、大蒜、黑麦、玉米、小麦和蚕豆。用品：显微镜、恒温箱、冰箱、水浴锅、分析天平、剪子、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、滤纸、量筒、培养皿、烧杯、滴瓶、酒精灯、切片盒、标签等。多媒体系统（附显微演示） 。2药品：无水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、蒸馏水、碱性品红、苏木精、秋水仙素、饱和对二氯苯溶液、0.002mol/L 8羟基喹啉、1mol/L 盐酸、4%铁矾水溶液、2%醋酸洋红染色液、2.5%纤维素酶和 2.5%果胶酶混合液。三、实验内容和实验步骤1
