细胞培养从头学

《细胞培养从头学》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞培养从头学（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、细胞培养基础常用设备 准备室的设备： 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品） 、储 品规（放置消毒过的物品） 、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品） 、PH 计（测量培养用液 PH 值） 、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液） 。 培养室的设备： 液氮罐、储品柜（存放杂物） 、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80） 、空 调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录） 。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞） 、 超净工作台、倒置显微镜、CO2 孵箱（孵育培养物） 、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱 （放置 serum 和培养用液） 。 无

2、菌操作 无菌室的灭菌： 1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用 3 来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5过氧乙酸擦拭。 2.CO2 孵箱（培养箱）灭菌：先用 3新洁尔灭擦拭，然后用 75酒精擦拭或者 0.5过氧 乙酸，再用紫外灯照射 3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟 4.实验后灭菌：用 75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 实验人员的无菌准备： 1.肥皂洗手。 2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋 3.用 75酒精棉球擦净双手。 无菌操作的演示： 1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培

3、养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75酒精擦拭瓶子 的外表面 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌 4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。 5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消： 一、新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。 2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干：12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗：用清洁液（

4、重铬酸钾 120g：浓硫酸 200ml：蒸馏水 1000ml）浸泡 12 小时， 然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。 5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。 6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升 时，关闭安全阀，当指针指向 15 磅时，维持 20-30 分钟。 7.高压消毒后烘干 二、旧的玻璃器皿的洗消： 1刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液 （洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。 2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液）

5、 ，12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗 （避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗） ，再用蒸馏水冲洗 3 次。 3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防 止灰尘和再次被污染。 4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升 安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指 针指向 15 磅时，调节电开关维持 20-30 分钟即可。 （玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上） 5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。 金属器械洗消： 金属器皿不能泡

6、酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75酒精擦拭， 再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅高压（30 分钟）消毒，再烘干备用。 橡胶和塑料： 橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用 烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序： 1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用 NaOH 泡 6-12 小时,或者煮沸 20 分钟,在包装之前要装好滤膜 两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅 内 15 磅 30 分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应

7、该立即将螺旋旋紧。 2. 胶塞烘干后用 2氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟（用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟） ，自 来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。 最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在 2氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时（切记时间不能过长） ， 自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。 最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 4. 胶头可用 75酒精浸泡 5 分钟，然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶，培养板，冻存管： 6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒

8、，又不能蒸气消毒，可用 70酒精浸泡消毒。 塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒 塑料制品，消毒后需要用 23 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000100000rad 的 r 射线 消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密 写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时_这种 墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯 化钻(CoC126H2o)2g，30盐酸 10m1，蒸馏水 88m1。 注意事项： 1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时

9、，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干， 水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高 压时爆炸。 2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。 3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B. 从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有 气泡，以防止泡酸不彻底。 细胞培养用液的配制与消毒 器材与试剂： 干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH 计、磁力搅拌器。具体步骤： 一. 水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净

10、，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯 净水 二.PBS 的制备与消毒(也可用于其它 BSS，如：Hanks，D-Hanks 液的配制)： 1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入 盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml，摇匀即成新配制的 PBS 溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入 高压锅内 8 磅消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 三. 胰蛋白酶溶液的

11、配制与消毒： 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作 用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0、温 度为 37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免 消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶 溶液时应选用不含 Ca2+、Mg2+的 BSS，如：D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液 或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的 双蒸水（若用双

12、蒸水需要调 PH 到 7.2 左右）或 PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于 4 内过夜。 2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22 微米微孔滤膜） 抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。 四.青、链霉素溶液的配制与消毒 1. 所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅高压 20 分钟灭菌。 2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位/瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉 素是 100 万单位/瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。 3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位/ml。1 单位1 微克. 五.

13、RPMI1640 的制备与消毒： 1.溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一 定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度 最终各为 100 单位/ml。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml，摇匀。 2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。 然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌

14、。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4冰箱内待用。 5.使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（4时两周有效） 。 六血清的灭火： 细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56水浴中灭火 30 分钟后，再经过抽滤方 可加入培养基中使用。 七.HEPES 溶液： HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ） 。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒 定的 pH 范围。使用终浓度为 10-50mmol/L，一般培

15、养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲 能力。 1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下： 准确称取 HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至 1L。过滤除菌，分装后 4保存。 注意：因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保 证培养液内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如：称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水 中，过滤除菌后可完全（20ml）加入 1L 培养液中，或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。 八.谷氨酰胺： 合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷

16、氨酰胺合成核酸和蛋 白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量 的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置 1 周可分解 50，故应单独配制， 置于-20冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在 4冰箱中储存 2 周以 上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 14mmol/L。可以配 制 200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸 水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保 存，使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。 九.肝素溶液的配制： 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml。因 为现在市售的多为肝素钠，包装为约为