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1、实验五实验五 激活剂、抑制剂、温度及激活剂、抑制剂、温度及 PH 对酶活性的影响对酶活性的影响一、目的要求 通过实验加深对酶性质的认识，了解测定 -淀粉酶活力的方法。二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制
2、剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约 30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和 PH 值称为某种酶作用时的最适温度和 PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一 PH 范围内酶活力可达最高，在最适 PH 的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。食品级 -淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微
3、生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的 -1,4 糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称-淀粉酶为液化淀粉酶。-淀粉酶不能水解淀粉支链的 -1,6 糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和 -1,6 键的寡糖。本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于 6 个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪 -淀粉酶作用于淀粉基质的水
4、解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响（一）试剂及材料1、1：30 唾液淀粉酶配置 用蒸馏水漱口，1min 后收集唾液，以 1：30 倍蒸馏水稀释。2、0.2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉 0.2g，预加 20mL 蒸馏水调匀，然后倒入 80mL 沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至 100mL。3、1%NaCl 溶液 称取 1.0 g 氯化钠，加水溶解稀释至 100mL 。4、1%CuSO4溶液 称取 1.0 g 硫酸铜，加水溶解稀释至 100mL。5、标准稀碘液 称取 11g 碘，22g 碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释
5、定容至 500mL。吸取 2mL 上述碘液，加入 10 g 碘化钾，用水稀释至 500 mL。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法取试管 3 根，编号后按下表配置实验样液。试管序号0.2%可溶性淀粉1%NaCl1%CuSO4蒸馏水1：30 唾液淀粉酶12.0 mL1.0 mL/1.0 mL22.0 mL/1.0 mL/1.0 mL32.0 mL/1.0 mL混匀，放入37水浴中保温10min。立即加入唾液淀粉酶。1.0 mL用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。四、温度与 PH
6、 值对 -液化淀粉酶活力的影响（一）试剂与材料1、2%可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉 2.0g（预先在 105烘干） ，预加 20mL 蒸馏水调匀，然后倾入 80mL 沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至 100mL。2、PH4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液（1）0.2 mol /mL Na2HPO4 称取 35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至 100mL。（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的 PH 值。3、供试酶液的制备 称取固体 -液化淀粉酶 1.00g，加入 PH6.0 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液 100mL (缓冲液的加入量视酶活力大小
7、而定，控制酶解反应在 5-10min 内完成)，于40恒温水浴中活化 0.5 小时，然后用 3000rpm / min 离心机离心分离 5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。4、标准比色液 甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾 0.4748 g，溶解并定容至500mL。乙液：称取铬黑 T 40.00mg，溶解并定容至 100mL。使用时取甲液 40.0mL、乙液 5.0 mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用 7 天后重新配置。5、标准稀碘液。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应
8、终点的标准色。2、不同温度对 -液化淀粉酶活力的影响 取 4 根 25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号12342%可溶性淀粉20.0mL20.0mL20.0mL20.0mLPH6.0 缓冲液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL把四根试管分别放入 50、60、70、80恒温水浴中预热 10min分别加供试酶液0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL50607080反应完成时间记录（min）加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2 滴反应液，滴入预先盛有 2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内 ，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶
9、作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。3、不同 PH 值对 -液化淀粉酶活力的影响 取 5 根 25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号2%可溶性淀粉缓冲溶液供试酶液反应完成时间记录（min）120mLPH4.0 5.0 mL0.5 mL320mLPH6.0 5.0 mL0.5 mL420mLPH7.0 5.0 mL0.5 mL520mLPH8.0 5.0 mL恒温水浴 60预热10min。 0.5 mL其它操作与温度对酶活力影响实验相同。五、结果计算和讨论淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g
10、酶制剂 1 小时内液化可溶性淀粉的克数。 酶活力单位(U/g)=nt5 . 0 102. 02060式中：20可溶性淀粉的用量（mL） ；t酶解反应完成所需的时间（min） ；0.5测定时稀释酶液用量（mL） ；0.02可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL） ；n酶制剂稀释倍数1、不同温度对 -液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果50607080酶活力（U/g）2、不同 pH 值对 -液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果pH4.0pH6.0pH7.0pH8.0酶活力（U/g）分别以 PH 值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制 PH 值酶活力单位、温度酶活力单位图。讨论分析实验结果。六、思考题1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？
