颗粒裂解肽g13结构域在大肠杆菌中的高效融合表达

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1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2009, February 25; 25(2): 235-241 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 2009 Institute of Microbiology, CAS Accepted: December 16, 2008 Supported by: Key Program of Natural Science Research of Anhui Provincial Universities (No. KJ2007A091), and the Innovation

2、Research Team of the 211 Projects of Anhui University (No. 02203109). Corresponding author: Xiangdong Zha. Tel: +86-551-5579103; E-mail: 安徽省高校省级自然科学研究重点项目(No. KJ2007A091), 安徽大学 211 工程学术创新团队项目(No. 02203109)资助。 系统生物技术颗粒裂解肽 G13 结构域在大肠杆菌中的高效融合表达 刘小强, 查向东, 肖亚中, 杨金环, 李能树 安徽大学生命科学学院 安徽省生态工程与生物技术重点实验室, 合肥

3、230039 摘 要: 为高效表达颗粒裂解肽 G13 结构域并避免 G13 对宿主菌的毒性, 将人工合成的编码 G13 的基因片段, PCR 扩增后克隆于原核表达载体 pThioHisA 中, 构建了重组表达载体 pThioHisA-G13, 将其转化于大肠杆菌 BL21(DE3)中, 经IPTG 诱导表达融合蛋白 Trx-G13, 表达产物以包涵体的形式存在, 其表达量约占细菌总蛋白的 58%。包涵体蛋白经 8 mol/L 尿素溶解后, 再经 CNBr 切割, 阳离子交换层析, 得到纯化的重组 G13 结构域。 琼脂糖扩散法检测表明重组 G13结构域多肽具有抗菌活性。 关键词: 颗粒裂解肽,

4、 G13 结构域, 融合表达, 阳离子抗菌肽 Efficient fusion expression of G13 domain derived from granulysin in Escherichia coli Xiaoqiang Liu, Xiangdong Zha, Yazhong Xiao, Jinhuan Yang, and Nengshu Li Key Laboratory of Ecological Engineering and Biotechnology of Anhui Province, School of Life Science, Anhui University

5、, Hefei 230039, China Abstract: The G13 domain derived from granulysin shows high antimicrobial activities against Gram-positive and Gram-negative bacteria but does not lyse Jurkat cells or liposomes. To explore a new approach for high expression of the G13 domain, we fused the sequence encoding G13

6、 to thioredoxin (Trx) gene to construct the recombinant expression vector (pThioHisA-G13). A cyanogen bromide (CNBr) cleavage site was introduced between the Trx and G13 to facilitate final release of the recombinant G13. The recombinant expression vector, pThioHisA-G13, was transformed into E. coli

7、 BL21 (DE3). Upon induction by IPTG, Trx-G13 fusion protein was expressed and took the form of inclusion bodies counting 58% (W/W) of total cellular proteins. The inclusion body was solved by urea (8 mol/L) and then cleaved by CNBr. We purified the recombinant peptide G13 by one-step cation exchange

8、 chromatography. Results of agarose diffuse assay analysis indicated that the recombinant G13 exhibited antibacterial activity. The procedure described in this study will provide a reliable and simple method for highly efficient production of some cationic antimicrobial peptides. Keywords: Granulysi

9、n, G13 domain, fusion expression, cationic antimicrobial peptide 抗菌肽(Antimicrobial peptide)是生物体内产生的一种阳离子小分子多肽, 广泛存在于植物和动物体内, 是天然免疫防御系统的一部分1。当前, 抗生素的大量使用导致耐药性菌株的产生, 因而开发新型抗生素显得越来越重要。抗菌肽是通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到广谱抗菌的效果, 所以不236 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2009 Vol.25 No.2 J 容易导致耐药性菌株

10、的产生和交叉抗性反应, 被认为是抗生素的替代品和增效剂2, 其潜在的价值已经受到人们的广泛关注。 颗粒裂解肽(Granulysin)是细胞毒性淋巴细胞CTL 和天然杀伤细胞 NK 内的颗粒中含有的一种阳离子抗菌肽, 对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、寄生虫均有杀菌活力, 尤其是对结核分枝杆菌有直接的细胞毒性3。 G13 结构域是颗粒裂解肽中含有一个螺旋和 loop 结构的肽段, 由 19 个氨基酸残基组成。Wang 等4化学合成不同大小的 granulysin 肽段, 发现G13 肽段可抑制细菌、真菌的活性, 但对动物细胞和脂质体没有影响, 因此具有重要的研究和应用价值。 抗菌肽的基因工程现

11、已成为研究热点, 建立了原核表达系统、酵母表达系统、昆虫系统等用于生产重组抗菌肽。然而在表达抗菌肽的过程中遇到了许多困难, 主要表现在抗菌肽对宿主菌产生毒性作用、易被蛋白酶降解以及表达水平低 3 个方面5。而本研究通过构建硫氧还蛋白(Trx)与 G13 的原核表达载体 pThioHisA-G13, 克服了 G13 对宿主细胞的毒性, 实现了高效重组表达, 琼脂糖扩散法证明了重组 G13 结构域多肽具有抗菌活性。这为进一步研究 G13 结构域的生物学活性及开发经济有效的生产方法打下了基础, 且有可能为其他阳离子抗菌肽的表达提供借鉴。 1 材料和方法 1.1 菌株及载体 Escherichia c

12、oli BL21 (DE3), DH5, 枯草芽孢杆菌, 表达载体 pThioHisA 均由本实验室保存。 1.2 工具酶及主要试剂 Taq DNA 聚合酶、IPTG、低分子量蛋白标准为上海生物工程公司产品, 限制性内切酶 EcoR I、 Sal I为美国 MBI Fermentas 公司的产品, T4 DNA 连接酶购自大连宝生物工程有限公司。质粒小量快速提取试剂盒、 琼脂糖凝胶 DNA 纯化回收试剂盒为北京道普生物公司产品, 酵母膏提取物、蛋白胨为 OXOID公司产品, 其他试剂为国产分析纯。 1.3 颗粒裂解肽 G13 结构域基因的克隆及原核表 达载体的构建 1.3.1 颗粒裂解肽G13

13、结构域的基因克隆 根据颗粒裂解肽 G13 结构域的氨基酸序列QRSVSNAATRVCRTGRSRW, 依照大肠杆菌偏爱密码子设计基因序列: 5-CAGCGTTCTGTGTCTAAC GCAGCAACTCGTGTGTGCCGTACTGGTCGTTCT CGTTGG-3, 由上海生工合成; 根据合成的颗粒裂解肽 G13 基因片段设计一对特异性引物, 上游引物P1: 5-AGAATTCATGCAGCGTTCTGTGTCTAAC-3, 下游引物 P2: 5-ATTGTCGACTTACCAACGAGAA CGACCAG-3(下划线部分分别为 EcoR I 酶切位点和 Sal I 酶切位点)。在上游引物中

14、引入了 EcoR I 酶切位点和 Met 密码子, 方便后来用 CNBr 将 G13 肽段从融合蛋白中切割下来; 下游引物中引入了 Sal I 酶切位点和终止密码子。 以 G13 结构域编码序列为模板, PCR 扩增 G13结构域。PCR 反应条件: 94oC 30 s, 62oC 15 s, 72oC, 15 s, 30 个循环。取 5 L 反应产物进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳, 鉴定扩增产物。用凝胶回收试剂盒回收相应片段。 1.3.2 表达载体的构建与鉴定 PCR 产物和载体 pThioHisA 均用 EcoR I、Sal I双酶切, 酶切产物切胶纯化后, 16oC, T4 DNA 连接酶

15、连接, 连接产物转化 E. coli BL21(DE3)感受态细胞, 氨苄青霉素筛选阳性克隆。重组质粒命名为pThioHisA-G13, 送上海博亚生物技术有限公司测序鉴定。 1.4 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及 G13 结 构域的分离纯化 1.4.1 融合蛋白的诱导表达及包涵体的处理 将含有重组质粒 pThioHisA-G13 的工程菌接种到含氨苄青霉素(50 g/mL)的 LB 培养基中 37oC 振荡培养过夜, 按 1%的接种量接种到相同的 LB 培养基中进行放大培养, 37oC 振荡培养至 OD600为0.50.6 时, 加入终浓度 1 mmol/L 的 IPTG, 37oC 振荡培养, 诱导 4 h 后, 8000 r/min 离心 10 min 收集菌体, 把菌体重悬于 Buffer A(50 mmol/L TrisHCl pH 7.9; 0.5 mmol/L EDTA; 50 mmol/L NaCl; 5% 甘油; 0.5 mmol/L DTT)中, 超声破碎菌体(超声 4 s, 间隔 6 s, 120 次循环, 功率 500 W), 12 000 r/min 离心 10 min, 取上清、沉淀进行 SDS-PAGE (5%分离胶, 15%浓缩胶)电泳。 将沉淀