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1、液相色谱-串联质谱技术在 水产品药残研究中的应用浙江省水产质量检测中心 张海琪2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用2 2选用LC-MS/MS技术的理由?光谱法：LC/UV/FL 灵敏度低，专一性不强 样品制备和分析耗时 一次分析很难同时检测多种分析物?免疫法：放射免疫测定 RIA 特异性差，易产生交叉污染 开发新的试剂盒所需时间长，费用高 一次分析无法同时检测多种分析物?LC-MS/MS法： 克服传统分析方法的局限性 筛选和确证同时完成 母离子和2个子离子符合欧盟4个IPs的要求 满足现代残留分析的所有要求 欧盟最近强烈推荐的方法2007-4-12HPLC/MS技术在水
2、产品药残研究中的应用3 3LC-MS/MS分析优缺点?MRM定量分析，特异性增强，混合组分不需完全分离， 快速。?样品软电离离子化，主要产生分子离子或准分子离子， MS/MS增加分析的特异性和选择性?应用范围广，大多不需要衍生化，样品处理相对简单?无标准谱库，定性分析难度大。2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用4 4三重四极杆质谱仪*高纯氮高纯氮离子源离子源Q1Q2Q3检测器检测器M+H+s碰撞诱导解离碰撞诱导解离 (CID)F1+, F2+, .*离子扫描模式计算机2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用5 5LC-MS/MS分析步骤第一步： Q1
3、 SCAN确定母离子的质荷比 根据待测化合物性质，选择分析的极性(/)、离子化方 式(ESI/APCI)，根据分子量选择扫描范围和时间 确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位。 参数设置： 扫描方式：Q1 Scan 质量范围： Parameter Range，100MW+30，t=1sec Center Width，MW5Da，t=0.6sec 通过手动调节DP、GS1，使喷雾平稳、有效2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用6 6第二步： Product Ion Scan 确定子离子的质荷比 得到高质量的MS2图，母离子的强度为图谱中基峰强度的 1/3到1/4为宜 平滑后
4、选择子离子质荷比，确定到小数点后一位 参数设置 扫描方式：Product Ion Scan 质量范围：Parameter Range，50MW+10，t=0.6sec 通过手动调节CELC-MS/MS分析步骤2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用7 7?第三步：优化化合物参数? 根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对? 选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时间? 用“Ramp”，优化Compound项下各参数，以及Source?项下CAD参数。各离子对应分别设定。? 初步建立MRM方法? 一般优化两次，以得到比较确切的结果LC-MS/MS分析步骤2007-4-12
5、HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用8 8第四步：方法转化：将连续进样方法LC-MS方法 关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液相色谱、 质谱设备。 单击Acquire中Build Acquire Method，打开上面保存过的MRM 方法，添加设备：色谱泵、自动进样器等。 设置色谱同步。 设置色谱参数，分析时间一般为0.61min，流动相组成和流量 与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间，与色谱参数一致； 设置GS1、GS2、TEM初始值为40、40、400左右，保存方法， 例如：LC-MRM.damLC-MS/MS分析步骤2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究
6、中的应用9 9第五步：FIA-优化Source参数 将前面用过的样品溶液稀释1001000倍。 在Tune项下，双击Quantitative Optimization，选择FIA分 析， 根据向导进行自动优化。不接色谱柱进行FIA定量优化 注意：需要优化的各可选值之间用“;”分隔。 当对源参数含义及设置比较清楚后，可以省略此步。 第六步：色谱条件优化 接好并平衡色谱柱，用适当浓度标准品考察分离情况 根据色谱分离情况，会设定梯度洗脱 MRM方式可以不必所有峰都基线分离，但要注意避开基 质离子抑制的干扰 调整色谱流动相组成和流速，并相应调整源参数LC-MS/MS分析步骤2007-4-12HPLC/
7、MS技术在水产品药残研究中的应用1010第七步：标准工作曲线的制作 空白基质添加标准品，稀释成不同浓度 根据LC流动相组成，选择稀释液，配制实际样品， 编辑批处理文件，排列进样顺序 平衡MS离子源和色谱柱 LC-MS/MS采集数据 第八步：数据处理 标准曲线的制做 正确积分色谱图 有内标和无内标的计算方法 最后结果的打印、存贮、复制LC-MS/MS分析步骤2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用1111LC-MS/MS分析流程总结2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用1212欧盟监测的化合物分类?禁止的物质（A组） 如氯霉素、硝基呋喃类、孔雀石绿 确认
8、至少需要4个IPs。?兽药（B组1，2类）如抗生素，驱虫剂等?污染物（B组3类）如重金属，二恶英等 确认至少需要4个IPs。 LC-MS/MS法母离子2个IPs，子离子1个IP。2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用1313热点关注热点关注1：对虾氯霉素事件：对虾氯霉素事件?因从舟山出口的对虾中，检出氯霉 素残留超标，欧盟随即发出公布： “从2002年1月1日开始，禁止从中 华人民共和国进口供人类消费或用 作动物饲料的一切动物源食品。” 直至2004年7月解禁。损失惨重。?2006年年11月月1日起正式实施的我国农产品质量安全法，首次明 确了农产品质量安全的责任主体，要求
9、农业行政主管部门制订实 施日起正式实施的我国农产品质量安全法，首次明 确了农产品质量安全的责任主体，要求农业行政主管部门制订实 施“农产品质量安全监测计划农产品质量安全监测计划”，并，并“对生产中或者市场上销售的农 产品进行监督抽查。对生产中或者市场上销售的农 产品进行监督抽查。?我国水产品质量安全影响较大的几个事件。我国水产品质量安全影响较大的几个事件。近年来水产品质量安全事件2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用1414?2006年10月18日，台湾媒体称，从中国大陆进口的 阳澄湖大闸蟹，验出含有禁用抗生素。台湾“卫生署” 称，今年9月1日至10月12日，大陆销到台湾
10、的大闸 蟹共154批，其中对59批进行抽检，至少有一批629 公斤检出含致癌物质硝基呋喃代谢物。热点关注热点关注2：大闸蟹硝基呋喃事件：大闸蟹硝基呋喃事件2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用15152006年11月17日，上海公布的一项抽查结果显 示，申城市场上销售的多宝鱼药物残留超标现象严 重。所抽的30件样品全部检出了硝基呋喃类代谢 物，且呋喃唑酮代谢物最高检出值为1mg/kg左右。 同时，部分样品还分别检出恩诺沙星、环丙沙星、 氯霉素、孔雀石绿、红霉素等禁用渔药残留，部分 样品土霉素超过国家标准限量要求。热点关注热点关注3：多宝鱼事件：多宝鱼事件2007-4-12
11、HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用1616?2005年，外商从广东出口的鱼产品中检验出孔雀绿石药物，这一 事件严重打击广东水产品的出口，仅香港一地，2005年1月-11月 份，从广东进口的水产品比2004年同期减少79%。?2006年11月24日香港特区政府署理食物安全专员何玉贤表示，香 港食物安全中心15个桂花鱼样本中，11个样本发现含有孔雀石 绿，占样本数量的近3/4，含量为0.00222.3ug/kg。港府已吁请 业界停售桂花鱼，而业界也同意要求商贩停售。热点关注热点关注4：孔雀石绿事件：孔雀石绿事件2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用1717?硝基呋喃类
12、测定（省科技厅重大科技攻关项目子课题、省地方标 准项目） 1、水产品中硝基呋喃类代谢物残留简便测定方法 2、呋喃唑酮在南美白对虾药物体内的代谢动力学研究 3、苗种中硝基呋喃类代谢物残留测定 4、养殖水体中硝基呋喃类代谢物残留测定液相色谱液相色谱-串联质谱检测技术的应用串联质谱检测技术的应用?孔雀石绿残留测定（省地方标准项目）?磺胺类药物残留多组分测定（省科技厅重点科研项目）?贝类毒素残留分析（在研，国家海洋局重大专项、省科技厅一般 科研项目?激素残留分析（在研，省药监局项目）2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用1818硝基呋喃类测定方法?1、苗种及水产品的样品处理?材料
13、来源材料来源： 实验用南美白对虾样品由项目课题组及中心实验室提供。 一组采用经水煮熟后取肌肉组织，另一组直接生剥取肌肉组织。?样品提取与净化样品提取与净化：称取适量均质肌肉样品（精确到0.01g）于50mL聚 丙烯离心管中，加入100L内标工作溶液（100g/L），再向离心管 中加入20mL 0.2mol/L盐酸溶液和1mL 8g/L 2-硝基苯甲醛，涡旋混合 1min，置于37恒温箱中保持16h以上。将上述衍生溶液取出放置至 室温，加入1mL 0.5mol/L磷酸氢二钾溶液，并用1mol/L 氢氧化钠溶液 调节溶液pH在7.07.4之间，每管加入5mL乙酸乙脂涡旋充分混合 后，4000r/m
14、in离心10min，取乙酸乙酯层于玻璃离心管中，再用5mL 乙酸乙脂重复提取一次，合并提取液。45水浴氮吹仪中用氮气吹 干，残留物用1mL流动相（乙腈与0.4%乙酸溶液体积比为15：85） 溶解，然后用2mL饱和正己烷去脂，4000r/min离心，下层溶液经 0.2m滤膜过滤后供HPLC-MS/MS仪测定。2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用1919?2、水样处理方法： 准确量取待测水样20mL于50mL聚丙烯离心管中，加入100L内标 工作液(100g/L)，用浓盐酸调节pH至2.0，再加入1mL 0.05mol/L2- NBA衍生剂，涡旋混合1min，置于37恒温箱
15、中保持16h以上。 取出放置冷却至室温，加入1mL 0.5mol/L磷酸氢二钾溶液，并用 1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH在7.0-7.4之间。然后加入6mL乙酸 乙酯涡旋混合1min后，于20下4000r/min离心，10min，取乙酸乙 酯层于10mL玻璃离心管中。再用5mL乙酸乙酯重复提取一次，合并 提取液。于45水浴氮吹仪中用氮气吹干，残留物用1mL流动相（乙 腈与0.4%乙酸溶液体积比为1585）溶解，然后用2mL饱和正己烷 去杂质，4000r/min离心，下层溶液经0.2m滤膜过滤后供HPLC- MS/MS测定。2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用202
16、0仪器条件?色谱条件：色谱柱为Zorbax XDB C18柱 （2.1mm150mm，5m）；进样量为40L；柱温为 35；流动相A相为乙腈，流动相B相为0.4%乙酸水溶 液，线性梯度程序为：30%的A相起始，以200L/min的 流速保持3min；然后迅速改为75%的A相，流速为 250L/min，保持5min；最后又回到30%的A相，流速为 200L/min，保持7min。2007-4-12HPLC/MS技术在水产品药残研究中的应用2121?质谱条件：离子化模式为+ESI，质谱分辨率为单位分辨率， 电喷雾电压为+5500V，辅助气流速为7L/min，离子源温度为 475，去簇电压为50V，聚焦电压为350V，其它条件见下 表。名称定性离子对（m/z）定量离子对 （m/z）采集时间 （ms）碰撞能量 （V）保留时间（min） 相对丰度比 （%）AMOZ33
