《实验四 酵母分批培养实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验四 酵母分批培养实验（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1实验四实验四 酵母分批培养实验酵母分批培养实验一、目的一、目的 1.掌握微生物分批培养的生物反应器操作； 2.掌握的菌体浓度、总糖等参数测定方法； 3.掌握分批培养的生长动力学及生长曲线的测定方法。 4.了解酵母的生长特性。 二、原理二、原理分批反应操作是指基质灭菌、接种以后，除了好氧反应需要在反应过程中通入无菌空 气、消除泡沫所用的消泡剂以及维持一定 pH 值所用酸碱之外，反应过程中不再加入反应 基质。 基质浓度、产物浓度以及细胞浓度均随反应进行的时间而变化，尤其是菌体本身将经历不 同的生长阶段（在培养的过程中，微生物的生长可分为迟缓期、对数生长期、减速期、静 止期） ，显示出不同的催化活
2、力。 基本特征是：反应物料一次加入一次卸出；反应器物系的组成仅随时间而变化，即随 着培养的进行，基质的浓度下降，菌体量增加，产物增加。因此它属于一非稳态过程。 三、主要试剂与设备三、主要试剂与设备酵母、培养基、菲林试剂、0.05N NaOH 1mg/ml 葡萄糖标准溶液等 100L 机械搅拌式反应器、pH 计、离心机、分光光度计等 四、步骤四、步骤 （一）准备工作（一）准备工作 1. 发酵罐的组装工作 （1） 连接好冷却水管。若采用自来水冷却，要考虑到白天与夜间水压的变化，尽可能 采用耐压管，连接部要充分牢固，并且注意连接管管径与自来水管管径应一致。 （2）由于通人的空气有一定压力，应注意连接
3、压缩空气的管子应能承受一定压力。 （3）安装 pH 及溶解氧等检测装置，注意各接线口不要出现差错。由于操作过程要和水 打交道，故线路连接一定要注意安全，要特别注意防止漏电。 2. 种子培养 （1）液体试管培养：自斜面菌种挑取一环酵母菌体，接入装有 10ml 10-12Bx 无菌麦芽 汁的液体试管中。摇匀，置于 30培养箱 24h. （2）三角瓶装培养：将上述培养好的液体试管种子接入 250m1 三角瓶的灭过菌的 100 10-12Bx 的麦芽汁，接种量 10%， 30培养箱 15-20h.3. 培养基的配置：按配方配置发酵罐。培养基的体积通常为罐容积的 50-60%。准确称量 培养基各组分，溶
4、解。一般配置培养基的体积为预定的 70%，因为灭菌时，通入的蒸汽发 生冷凝，会使发酵液的体积增加。使用合成培养基时，将糖类及磷酸盐溶液分别用高压灭 菌锅灭菌，开始培养前放入发酵罐内，这是为了避免灭菌时糖类物质与氨基化合物反应生 成褐色物质，以及防止磷酸盐与其它金属离子生成沉淀。4. 发酵装置(罐)的清洗发酵罐使用前后都应认真清洗，特别是前后两次培养采用不同的菌株时，更应注意清 洗和杀菌工作。发酵罐有多种型式，罐内(可进行清洗的)任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂 菌的滋生地。一般认为，发酵前期引起杂染菌的主要原因是由于清洗不净。易被忽略而未 能充分清洗的地方有喷嘴内部与取样管内以及罐顶等处
5、。另外，还应充分注意发酵罐周围2的附件设备，如加热器、电机等的安全使用。 5. 电极的标定 对 pH 电极和溶氧电极进行零点校正和斜率校正。 6. 参数的控制及设定根据发酵要求在操作面板或反应器应用程序上进行设定。 发酵控制参数值如下：温度 30 时间 48h, 空气流量 转速 80-100r/min （三）发酵罐发酵（三）发酵罐发酵 步骤如下： 清洗空消实消冷却接种发酵取样放罐 1. 蒸汽的产生 （1）打开蒸汽发生器进水阀和放气阀，加水至水位上限，关闭进水阀和放气阀。 （2）启动蒸汽发生器电源开关加热至 0.40MPa 左右。 2. 空消 空气过滤系统只空消，不实消，以免实消罐中物料冲入过滤
6、器内空气过滤系统只空消，不实消，以免实消罐中物料冲入过滤器内； （1）通蒸汽前检反应器所有阀门是否关闭。 （2）打开蒸汽发生器排冷凝水的阀门，排放冷凝水至蒸汽出现，关闭此阀门；然后打 开蒸汽发生器供给反应器蒸汽的阀门。 （3）进蒸汽顺着蒸汽管路开阀门，蒸汽为活汽。打开罐顶排气，先对空气过滤系统灭 菌，顺着气路开阀，再开尾阀排冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打 开主阀，保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压；再进罐体，蒸汽分三路进 罐，先主管道，后次管道；蒸汽也按以上规则顺行进路径开阀，先开支路阀，再 开排汽阀，最后为进罐阀。 （4）罐压升至 0.12MPa(此时控制系统中温度读数约为
7、120左右)时开始计时，灭菌 30min。灭菌时，保持各阀排气通畅，防止存在死角。保压方式：保压方式：a. 调节主汽路调节主汽路 进汽阀门控制进汽量；进汽阀门控制进汽量；b. 调节空气排气口阀门大小或出汽阀大小。调节空气排气口阀门大小或出汽阀大小。 （5）灭菌结束时，逆着进路关阀门。空气过滤系统先关主阀后关尾阀，完成；进罐蒸 汽管路先关进汽阀，再排汽阀，最后为支路阀。但空消一结束，即要通入无菌空但空消一结束，即要通入无菌空 气吹干空气过滤系统管路并保压，避免染菌。气吹干空气过滤系统管路并保压，避免染菌。 （6）打开罐顶排汽阀直至表压为零，再通过罐底排空罐里的冷凝水。 注：粗过滤器不空消也不实消
8、，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。注：粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。 3. 实消 （1）将 pH 电极和溶氧电极装上，悬紧螺旋。 （2）打开进料口进料。 （3）进料完成后，向夹套中通入蒸汽将发酵液加热至 80以上，关闭蒸汽阀门。随 后向发酵液通入蒸汽至 0.12MPa，保持 30min。灭菌时，保持排气通畅，使罐内 空气充分排出，同时使出口管内灭菌更充分。如果不预先加热夹套，会生成大量 的冷凝水，导致发酵罐内发酵的培养基的体积很难控制。 4. 冷却：灭菌结束后，立即打开冷却水（下进上出）至 30。 5. 接种、发酵：适当降低通风量，使高压接近零
9、。在接种口（进料口）周围放置浸有酒精的棉花， 点燃后迅速打开接种口，将菌种加入到发酵罐中，旋紧接种口盖子，熄灭火焰，调节3通风量，接上玻璃转子流量计，使流量计读数在 8.0 左右，同时保持罐压 0.04Mpa，保 温保压发酵 48hr 6. 取样培养基放入罐前取 50ml，测定其还原糖，菌体量。发酵每隔 4h 后取样 100 m 测定 菌体量、总还原糖。取样时，将取样口最初的 10ml 培养液弃掉。 具体操作如下： （1）须提前半小时，开启蒸汽发生器，送入蒸汽，开启阀门 1，2，蒸汽灭菌。 （2）半小时后，关阀门 1，立即开启阀门 3，先放弃部分培养液，再取样 100ml 左右至灭菌三角瓶中（
10、标注好取样日期、时间、取样人） ，冷藏备测。 （3）关闭阀门 3，开启阀门 1，半小时后关闭阀门 2，再关阀门 1。 7. 放罐： 培养完成时，除取出足够量的培养液作为样品外，剩余培养液要经过杀菌处理。此时 发酵罐所装有的电极可一同经杀菌处理。如果培养液为无害物质，可将电极单独取出处理， 以利于延长电极使用寿命。 杀菌完成后，温度降低到一定温度时，取出电极，将杀菌后培养液丢弃到指定地点。 一般培养液温度较高时，有难闻气味产生，因此，排放温度应尽可能低一些。8. 清洗： 空罐后，加大排气，使表压掉零，取出各探头，加盖，由进料口加入净水关好，罐内 升压，放罐，如此重复两次。清洗、空消、实消、冷却操
11、作完全一致； 五、记录、数据处理五、记录、数据处理 （一） 测定方法： 1. 菌体浓度测定： 将培养液适当稀释后，在 660nm，波长下测其浊度，同时采用血球记数。2. 还原糖测定方法： 采用菲林法测定。（二） 记录： 数据采集：系统自动采集，每 2min 采集一组数据并存贮，包括：温度、溶氧、pH、 等，系统可自动给出有关曲线。同时由值班者每 30min 记录一次，准确填表，获取数据制 作过程曲线。 值班人员做好记录，发酵罐每隔 4h 取样。按表 1 记录。表表 1 酵母发酵批报酵母发酵批报 罐批 1 接种时间 14:26 放罐时间 取样时间14:4419:2022:3001：2004：20
12、07：2015：24培养时间/h0.30 4.90 8.07 10.90 13.90 16.90 24.97 pH6.075.935.44.934.474.494.11 罐温33.90 30.20 31.10 31.10 31.70 32.00 32.40 OD0.943 0.883 1.250 1.360 1.516 1.514 1.880 菌体浓度/（个/1.00E-4mL）71055510701290178050785250 还原糖/(mg/100mL)2688244420671920168015198404取样时间18：2 421：2 800：2 803：2 806：2 809：2 8
13、11：1 8 培养时间/h27.97 31.03 34.03 37.03 40.03 43.03 44.87 pH3.953.913.813.753.883.853.84 罐温31.50 30.20 31.70 32.00 31.80 32.00 OD1.992 1.927 4.832 4.572 3.916 4.468 4.468 菌体浓度/（个/1.00E-4mL）5550530047202940104034005380 还原糖/(mg/100mL)67243027221379.552.544.6（三）以时间为横坐标，菌体浓度、 还原糖%、pH、OD 为纵坐标作图，观察各参数的 变化。采用
14、计算机拟和对数生长期的动力学方程。 图 1 菌体浓度-t 图菌体浓度-t图01000200030004000500060000.0010.0020.0030.0040.0050.00 培养时间/h菌体浓度/（个/1.00E-4mL）图 2 还原糖-t 图5还原糖-t图0500100015002000250030000.0010.0020.0030.0040.0050.00 培养时间/h还原糖/(mg/100mL)图 3 pH-t 图pH-t图012345670.0010.0020.0030.0040.0050.00 培养时间/hpH图 4 OD-t 图6OD-t图0.0001.0002.000
15、3.0004.0005.0006.0000.0010.0020.0030.0040.0050.00 培养时间/hOD由图 1 可看出，22:30-07：20 为对数生长期 表 2 对数生长期部分数据表 取样时间19:2022:3001：2004：2007：20 培养时间/h4.90 8.07 10.90 13.90 16.90 OD0.883 1.250 1.360 1.516 1.514 菌体浓度/（个/1.00E-4mL）5551070129017805078 还原糖/(mg/100mL)24442067192016801519 pH5.935.44.934.474.49 t-t03.17
16、 6.00 9.00 12.00 In(X/X)00.6560.8431.1652.214 注：t 为培养时间/h，X 为菌体量/（个/1.00E-4mL）。tX为 19：20 时对应的 培养时间和菌体浓度，t=4.90，X=555（个/1.00E-4mL） 图 5 以菌体数量拟合对数生长期动力学方程In(X-X)-(t-t)y = 0.1701x - 0.0635R2 = 0.867100.511.522.50.002.004.006.008.0010.0012.0014.00 t-tIn(X-X)所以，对数生长期动力学方程：dX/dt=0.1701X （四）用图示表示比生长速率=(dX/ dt) /X 随时间变化趋势。7培养时间/h0.30 4.90 8.07 10.90 13.90 16.90 24.97 菌体量
