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1、遗传学报，2003，30（7） ：668-672 1梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向 消减 c D N A 文库的构建1徐德全1， 张义兵2， 熊远著1 *，桂建芳2，蒋思文1，苏玉虹11华中农业大学农业部猪遗传育种重点实验室（4 3 0 0 7 0 ） 2中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室（4 3 0 0 7 2 ） E-mail: 摘 要：以梅山猪和长白猪的背最长肌为材料，利用抑制性消减杂交技术，成功构建了梅山 猪与长白猪肌肉组织间正反向消减 c D N A 文库。以管家基因 G 3 P D H 作为消减指标，检测梅山猪 和长白猪两个消减文库的消减效率分别高达 21 0
2、和 25倍，表明某些特异于两种肌肉组织的差异表达基因的富集效率也分别接近 21 0和 25倍。从两个消减文库中分别筛选到了 7 0 9 和 6 7 3 个有效阳性克隆，P C R 鉴定插入片段长度主要分布于 1 5 0 7 5 0 b p 之间。不同猪种肌肉组织间消减 c D N A文库的构建为进一步分离和鉴定影响肌肉生长和肉质的基因奠定了基础，对探讨肌肉生 长机理和肉质决定因素，以及应用于分子育种具有重要意义。 关键词：猪 肌肉组织 差异表达基因 消减 c D N A 文库 抑制性消减杂交 1 引言 国内外猪种由于来源、长期所处的地理环境以及所接受的饲养方式和选育性状重点的不 同，使其在肌肉
3、的生长和肉质等方面各有优缺点。其中，梅山猪不仅以产仔数高闻名于世， 且肉质优于欧洲猪种，但其具有较低的日增重和瘦肉率以及较厚的背膘 1 。合理利用这些差 异，弄清这些差异的原因，将为猪育种提供有效的途径。 细胞遗传学研究表明，中外猪种的染色体 C带型、A g - N O R多态性存在差异，甚至被公认 为比较稳定的 G 带型和 Q 带型也发现多态的存在 2 。 分子遗传学研究更明确地表明中外猪种基 因组存在明显的差异，这些差异不仅包括单个碱基或少量碱基的不同，如 F O S 3 等；而且包含 较大片段的差别 4 。但目前还很少有中外猪种基因表达水平差异的研究，而研究中外猪种基因 表达的差异是弄清
4、导致中外猪种性状差异原因的重要途径之一。抑制性消减杂交 （S u p p r e s s i o n S u b t r a c t i v e H y b r i d i z a t i o n ，S S H ） 5 技术是继 m R N A差异显示（m R N A D i f f e r e n t i a l D i s p l a y ，D D ）技术 6 和代表性序列差别分析（R e p r e s e n t a t i o n a l D i f f e r e n c e A n a l y s i s ，R D A ）技术 7 之后又一新的表型克隆技术，其克服了 D D 技术
5、假阳性率高和 R D A 技术 消减杂交轮次较多的缺点，且对高、低丰度的差异表达基因都可有效分离。利用其研究中外 猪种基因表达水平的差异，将对中外猪种性状差异原因的探讨具有重要的意义。 猪骨骼肌基因对猪肌肉的生长和肉质具有重要的决定作用 8 。 本研究利用 S S H 技术构建了 梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减 c D N A 文库， 用于中外猪种肌肉生长和肉质差异的研究。 试图通过分离和鉴定影响猪肌肉生长和肉质的重要基因，弄清不同猪种间肌肉生长和肉质差 异的遗传基础，丰富人们对肌肉生长和肉质形成机理的认识，并将所分离和鉴定的基因直接 应用于猪的育种研究。 2 材料和方法 2 . 1 猪肌
6、肉样的采集 实验用肌肉样采自华中农业大学精品猪场的同日龄梅山猪与长白猪的背最长肌，置液氮 1本课题得到 8 6 3 国家高技术研究发展计划（项目编号：2 0 0 1 A A 2 1 3 1 2 1 ）和 9 7 3 国家重大基础研究项目（项目编号：G 2 0 0 0 0 1 6 1 0 5 ）资助；* 为通讯作者。 _遗传学报，2003，30（7） ：668-672 2备用。每品种采集 3 头，每头选自不同窝次的最接近窝平均重的 2 月龄母猪。 2 . 2 方法 2 . 2 . 1 肌肉总 RNA 的提取及 mRNA 纯化 根据 RNA Extraction Kit（Pharmaica 公司）
7、操作手册，利用三氟乙酸铯盐(CsTFA)密度梯 度超速离心法提取 3 头梅山猪与 3 头长白猪背最长肌的总 RNA，并分别混合形成梅山猪与长 白猪的 RNA pools。随后利用磁珠法（Promega 公司）从 RNA pools 中分离、纯化 mRNA。 2 . 2 . 2 抑制性消减杂交 具体操作按照 PCR-Select cDNA Subtraction Kit（Clontech 公司）进行。首先分别制备梅 山猪和长白猪肌肉组织的 Driver cDNA 和 Tester cDNA。Driver cDNA 的制备是：梅山猪和长 白猪肌肉组织 mRNA 逆转录合成双链 cDNA， 然后用
8、Rsa充分酶切 3 h 后完成。 Tester cDNA 的制备是：将合成的双链 cDNA 用 Rsa酶切后，分成两份，分别与 adaptor 1 和 adaptor 2R 连接后即制成 Tester-1 cDNA 和 Tester-2 cDNA。 然后以制备好的梅山猪和长白猪 Driver cDNA 和 Tester cDNA 分别进行抑制性消减杂交。 当制备梅山猪肌肉组织的消减 cDNA 时， 以梅山猪 Tester cDNA 与长白猪 Driver cDNA 进行杂 交；反之，当制备长白猪肌肉组织的消减 cDNA 时，则以长白猪 Tester cDNA 与梅山猪 Driver cDNA
9、杂交。抑制性消减杂交过程为，首先将 Tester-1 cDNA 和 Tester-2 cDNA 分别与 Driver cDNA 进行第一次杂交，混合两种杂交产物，再与新变性的 Driver cDNA 进行第二次杂交，杂 交产物然后以引物 primer 1（试剂盒提供）进行第一次 PCR 扩增，第一次 PCR 产物再用引物 nested primer 1 和 2R（试剂盒提供）进行第二次 PCR 扩增，使特异于梅山猪或长白猪肌肉组 织的差异表达基因得到指数扩增。 2 . 2 . 3 消减效率检测 用管家基因 G3PDH 特异的 5 引物（5 -ACCACAGTCCATGCCATCAC -3 ）和
10、 3 引物（5 -TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3 ）对消减 cDNA 文库进行 PCR 检测消减效率，同时，以 未经抑制性消减杂交的 cDNA（在制备 Tester cDNA 连接两种接头时，将刚刚加好样还没有进 行连接反应的 Tester-1 和 Tester-2 cDNA 各取 2l 混合，然后进行连接反应完成）进行 PCR 作 为对照。PCR 反应条件为：94预变性 5 min，然后 94 30sec、60 30sec、72 1 min 扩 增，分别在第 18、23、28、33 循环处取 5l 进行电泳，检测消减效率。 2 . 2 . 4 消减 cDNA 文库的构建（T
11、/ A 克隆法）及消减 cDNA 片段的初步鉴定 将制备的消减 cDNA 群体与 pGEM-T（Promega 公司）载体连接，即完成梅山猪与长白猪 肌肉组织间正反向消减 cDNA 文库的构建。将连接产物转化受体菌 JM109，涂布于含 X-gal/IPTG 和 Amp 的琼脂平板上，37培养过夜，随机挑取白色克隆，培养 5 h 以上。取 1l 菌液作模板，以 nested primer 1 和 2R 为引物进行 PCR，鉴定消减 cDNA 片段。PCR 反应条件 如下：94 5 min，然后 94 10 sec、68 30 sec、72 1.5min 扩增 30 个循环。 3 结果与分析 3
12、 . 1 肌肉 RNA 的提取 用CsTFA密度梯度超速离心法提取的梅山猪与长白猪肌肉组织RNA经紫外分光光度计测 定 OD260/ OD280的比值均在 2.0 以上。电泳显示 RNA 弥散带主要位于 0.5kb 以上，28S、18S 条带清晰，且前者浓度大于后者的两倍（图 1） ，表明用于建库的 RNA 质量很好。 3 . 2 接头连接效率的检测 dscDNA 与接头连接效率的高低是决定抑制性消减杂交成败的非常关键的一步。利用管家 基因 G3PDH 的 3 、5 特异引物以及 G3PDH 的 3 特异引物与接头的外侧引物 primer 1 对两组 Tester cDNA 进行了检测。 结果
13、显示 （图 2） ： G3PDH 的 3 特异引物与接头的外侧引物 primer 1 组合的扩增片段（结合接头后的 PCR 产物）大于 G3PDH 的 3 、5 特异引物组合的扩增片段，中国科技论文在线_遗传学报，2003，30（7） ：668-672 3且有较高的产量，与预期一致。表明 dscDNA 与接头已经成功连接。 3 . 3 消减效率检测 为评价消减 cDNA 文库的消减效率， 以 G3PDH 基因在消减杂交后 cDNA 和未经消减杂交1 2 3 4 M 5 6 7 8 1 2 3 4 M 5 6 7 8 A B 图 3 PCR 检测 G3PDH cDNA 的消减效率 （A）以梅山猪
14、为 Tester （B）以长白猪为 Tester M：DL 2 000 DNA 分子量标准；14：消减 cDNA 的产物；58：未消减 cDNA 的产物； 1,8：33 个循环；2,7：28 个循环；3,6：23 个循环；4,5：18 个循环 Fig.3 Subtraction efficiency of G3PDH cDNA between subtracted and unsubtracted cDNAs detected by PCR （A）Meishan as Tester （B）Landrace as Tester M：DL 2 000 DNA molecular weight ma
15、rker；Lanes 14：products of subtracted cDNAs； Lanes 58：products of unsubtracted cDNAs；Lanes 1 and 8：33 cycles；Lanes 2 and 7：28 cycles； Lanes 3 and 6：23 cycles；Lanes 4 and 5：18 cycles 图 1 RNA 电泳结果 M：/EcoR I+Hind III 双酶切分子标准量；1：梅山猪 RNA pools；2：长白猪 RNA pools Fig.1 The results of RNA electrophoresis M：/EcoR I+Hind III DNA molecular weight marker；Lane 1：RNA pools isolated from Meishan； Lane 2：RNA pools isolated from Landra
