不加三乙胺进行含氮化合物的色谱分离

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1、不加三乙胺进行含氮化合物的色谱分离不加三乙胺进行含氮化合物的色谱分离上一篇 / 下一篇 2008-06-11 12:43:50查看( 359 ) / 评论( 0 ) / 评分( 0 / 0 )引言引言用反相 HPLC 分离碱性化合物时，色谱色谱峰的拖尾问题是大多数色谱工作者非常关注的问题。碱性和含氮化合物能形成能满足分离和定量要求的对称峰。由于许多生物活性化合物都含氮，因此给这些药物和植化成份的 HPLC 分析带来了困扰。用反相 HPLC 分离碱性化合物时，色谱峰的拖尾问题是大多数色谱工作者非常关注的问题。碱性和含氮化合物能形成能满足分离和定量要求的对称峰。由于许多生物活性化合物都含氮，因此给

2、这些药物和植化成份的 HPLC 分析带来了困扰。有几种克服硅醇基相互作用所致峰拖尾的办法。常用的措施是降低流动相的 pH 值，一般 pH 值小于 3 时硅醇基将不再引起峰拖尾。在 pH 值小于 3 时，硅胶基质上的硅醇基被质子化（硅醇基的 pKa 约为 3.5），从而使硅醇基与溶质的相互作用减少。但是，这样也可能改变了分离的选择性和分离度，因此也不一定是好的选择。第二个措施是提高流动相的离子强度。通过增加流动相的缓冲容量，抑制碱性化合物与硅胶之间的相互作用。但是，当增加的缓冲液在仪器仪器内外/在进行色谱分析时发生沉淀，特别是在泵密封垫上发生沉淀时，可能会带来其它问题。应注意根据缓冲范围使用适当

3、的缓冲液。表 1 列出了几种最常用的缓冲液。另一个可能的解决办法是在流动相中添加三乙胺(TEA)。TEA 作为一种竞争碱，减少了固定相硅醇基的可用性，也减少了分析物与硅醇基之间的相互作用。一些色谱工作者不赞成在流动相中加入竞争性胺，因为这使流动相添加了额外成分，将给色谱柱造成不可恢复的改变。要从色谱柱上洗掉较强的胺，如 TEA，非常困难。这一现象的一个例子就是，系统中使用 TEA 后，正离子模式电喷雾 LC/MS 一直有 m/z 为 102 的离子，说明污染污染的不只是柱子，还有管路1。要除去 TEA，需要用 5% 到 10% 的醋酸清洗系统。也就是说，被 TEA 修饰过的柱子不再适用于那些流

4、动相中不含 TEA 的应用。TEA 的作用是竞争性碱，让可能反应的硅醇基饱和，从而减少峰拖尾的可能性。对大多数分析来说，10 mM 的 TEA 已经足够，但许多情况下可能使用得更多。而且，TEA 的碱性很强，如果添加到没有缓冲或弱缓冲能力的流动相中，可能导致溶剂 pH 值急剧升高，可能会损坏色谱柱，进而影响分离，最终缩短柱寿命。最好的解决办法是使用对 TEA 需求最少的色谱柱。Eclipse Plus 采用了专利的硅胶处理技术，改进了键合和封端工艺，不用添加 TEA，靠色谱柱本身就能降低峰拖尾。实验部分实验部分所有分析都在 Agilent 1200 上进行，系统包括一个自动进样器、二极管阵列检

5、测器、二元泵、脱气机、柱温箱。法莫替丁、甲氰脒胍和哌仑西平样品购自 Sigma Aldrich（St. Louis，MO，美国美国）。将这些样品溶解在 50/50 MeCN 乙腈/水中。白毛茛样品在当地购买，按照参考文献 2 中的步骤，用 70/30/0.1% v/v/v 水/乙腈/磷酸提取，超声、离心，用提取溶剂稀释。黄藤素、黄连素和白毛莨碱标准标准购自 Sigma Aldrich，用流动相配制。用这些标准品鉴定白毛茛提取物。结果与讨论结果与讨论图 1 是 Eclipse Plus C18 柱和另一种 C18 柱上分离三种治溃疡药物：法莫替丁、甲氰脒胍和哌仑西平（添加 TEA 和不加 TEA

6、）的色谱图。这三种含氨基药物的结构见图 2。甲氰脒胍和法莫替丁是组胺 H2-受体拮抗剂，通过关闭产生胃肠液的通路治疗治溃疡。哌仑西平是一种 M1-竞争性毒蕈碱受体拮抗剂，能抑制胃酸的产生。治溃疡药是最常用的药物。从图 1 中可以看出，加入 10 mM 的 TEA 后，三种分析物在 C18 柱上的峰形得到了改善。加入 TEA 后哌仑西平峰的拖尾因子从没加 TEA 的 1.74 变为 1.02。但我们注意到，只要换成 Eclipse Plus C18 柱，甲氰脒胍和哌仑西平的峰形和柱效都有了改善。实际上，这些峰的拖尾因子与使用了 TEA 的 C18 非常接近，柱效更高。用 Eclipse Plus

7、 C18 分析时，不需要任何流动相改性剂就能得到很好的峰形和柱效。图 3 显示了 Eclipse Plus C18 柱在分析功能食品食品白毛茛中的应用。白毛茛一直用做抗菌、抗炎、减充血剂，用于治疗各种肠道紊乱，是使用最广泛的功能食品原料之一。采用一种通用的方法2，评价 Eclipse Plus C18 和另一种 C18 柱，加 TEA 和不加 TEA 的分离效果。在这个例子中，我们测定了 500-mg 市售白毛茛根的提取物。白毛茛的两个主要成分是黄连素和白毛茛碱。方法中提到了黄藤素，但是在测定的植物 Hydrastis Canadensis L（北美黄连）中没有检测到。这些氨基化合物的结构见图

8、 4。从色谱图中可以看出两点。第一，与另一个 C18 柱相比，黄连素在 Eclipse Plus C18 上的峰形有所改进。第二，随着 TEA 的添加，C18 柱的选择性有了明显改善。最后要注意的一点是，在含 TEA 的色谱图开始处有许多鬼峰或负峰。因为添加组分(14 mM TEA)加入到流动相中后，又加酸重新调节 pH，简单的流动相变复杂了，甚至变脏了。包括高质量的新鲜试剂的最好的实验室实验室操作，可以避免这一问题，但流动相污染的可能性仍然存在。更好的选择是不加 TEA。结论结论由氨基和硅醇基离子化产生的峰拖尾现象，通常可以通过降低流动相 pH、增加缓冲液离子强度，或添加竞争碱，如 TEA，得到缓解。这些措施虽然减少了峰拖尾，但也可能给方法开发带来挑战，如选择性或分离度变差，降低柱寿命等。新的解决方案是用 Eclipse Plus C18 固定相。它的硅醇基活性低，能为碱性化合物提供卓越峰形和柱效。