番茄早疫病对几种种农药的抗药性研究

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1、 番茄早疫病对番茄早疫病对 3 种农药的抗药性研究种农药的抗药性研究番茄早疫病菌是番茄重要病害之一。近年来，由于一些地区推广抗病毒病而不抗早疫 病的番茄品种，导致早疫病严重发生。发病时可引起落叶、落果和断枝，对产量影响很大， 常年减产 20一 30，严重时可达 50以上，甚至绝产。由于番茄早疫病具有潜育期短、 再侵染频繁、流行速率高的特点 H1，长期使用单一药剂防治，在药剂的选择压力下病原 菌容易形成抗药性群体。目前国内针对番茄早疫病抗药性的研究刚刚开展，这次试验主要 测定其对嘧菌酯、腐霉利及代森锰锌 3 种化学杀菌剂的敏感性，为其推广和科学使用提供 了理论依据。 1 材料与方法材料与方法1.

2、1 菌种的采集菌种的采集 番茄早疫病菌采自于临安的农田及学校的农场基地里德番茄早疫病株果实或叶片上， 按随机取样的原则进行。取样后将所得的各组织分别装入小袋隔离，带回后对其进行分离 纯化。菌株以“采集地点的大写拼音开头+序号”命名。 1.2 供试药剂供试药剂 95嘧菌酯原药，由浙江东风化工有限责任公司提供；978腐霉利原药，由南京 仁信化工有限公司提供；8162代森锰锌原药，由浙江东风化工提供。 1.3 菌种的分离与纯化菌种的分离与纯化 131 孢子分离法孢子分离法 用经过灭菌的接种刀刮取发病叶背表面霉层，接入 PDA(马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20g，水 l 000 m1)

3、平板培养基表面，25下培养，待长出菌丝后，用灭菌的接 种针挑取早疫菌丝转入另外一个 PDA 平板培养基上纯化菌种。 132 组织分离法组织分离法 将采集到的病叶组织切成 35 mill 的方形小块，在 75乙醇溶液里浸 23 s，然后 浸在 15的次氯酸中漂洗 3 min，最后用无菌水洗涤 34 次。经表面消毒的病组织放置 在 PDA 平板培养基，在 25左右恒温箱内保存，直到产生孢子或菌丝为止(约 45 d)， 用灭菌的接种针挑取孢子或菌丝，移到新的 PDA 平板培养基上。 133 单孢分离法单孢分离法 将番茄早疫病菌在 PDA 培养基七培养一周后，注入 4的无菌水，刮取气生菌丝， 紫外线照

4、射 2min，于 20 一 22下干燥 6 h 后皿内即可产生大量的分生孢子。在培养一周 的菌落上用打孔器打下 5 个菌碟 j 放在 PDA 平板培养基上，用涂抹器涂布均匀。25培 养 24 h 后对已萌发的单个孢子进行标记，48 h 后再把标记的单个菌落移入斜面培养基。 14 病原菌的确定病原菌的确定 病原菌的鉴定利用赫柯氏法则，将分离出的菌株再接回到番茄叶片上，验证是否为病 原菌。从菜园中采集健康的番茄叶片带回室内，用无菌水冲洗，然后在无菌的条件下用 75的酒精浸泡 2 min 并用无菌水换洗 5 次，最后放到带滤纸的灭菌培养皿中。用棉球包 裹叶柄的基部并从各分离菌株菌落的边缘用接种针挑取

5、直径 4 mln 的圆形菌落接到叶背 面的两侧，每菌株接 3 个菌块，置于 25培养。3 d 后记载发病情况并观察病斑子实体形 态。 15 含药培养基的制备含药培养基的制备将 95嘧菌酯原药溶于甲醇溶液中，配成 10 000 斗 srnl：母液，代森锰锌和腐霉 利溶于丙酮溶液中，分别配成 10 000 tl，sml 和 5 000 斗 sml 的母液，都以 02的 量加入乳化剂 Tween80。母液于冰箱 4贮藏备用，使用时以无菌水稀释至适当浓度，以 10的药液量加入熔化的 PDA 培养基中(冷却至 4550 oC)充分摇匀，制成含最终所需药量的 PDA 平板，用以进行敏感性测定及其他试验。

6、16 敏感基线的建立及敏感性的测定敏感基线的建立及敏感性的测定 由于没有采集到番茄早疫病菌的野生菌株，也未见该病菌对杀菌剂敏感基线的报道。 浙江省偏远山区建德里中垅从未用过任何杀菌剂，该研究将该地采集分离的菌株所测得的 EC50值作为相对敏感基线。由于各杀菌剂杀菌作用方式的区别，对嘧菌酯敏感性测定采 用孢子萌发抑制法，对腐霉利及代森锰锌的敏感性采用 FAO 推荐的菌落直径法一-。 从预培养的番茄早疫病菌同一圆周的菌落上制取边缘菌碟置于 PDA 培养基上，25 培养 10 d。用无菌水将培养好的孢子从培养基上洗下，4 层纱布过滤，滤液即为孢子悬浮 液。浓度调至 5105 个ml。 在超净工作台上

7、，将嘧菌酯母液与 PDA 培养基配制成含 0625、0125、0025、0005、000l 和 0ugml 系列浓度的含药平板，将制好的 孢子悬浮液均匀涂布于 PDA 培养基上，以 9 ml PDA 培养基加 1 ml 无菌水为对照，重复 3 次。放入 25恒温培养箱中，暗箱培养。48 h 后观察孢子萌发数(取 3 次重复的平均值)。 以药剂浓度负对数和抑制率机率值计算毒力回归方程 Y=a+bX，根据方程计算有效抑制中 浓度(EC50)和相关系数。将被测菌株在 PDA 平板上培养 72 h 后，自菌落边缘打取直径为 4 mm 的菌碟，在含药平板上进行敏感性测定，设置 58 个梯度浓度，以不加药

8、者为对 照，每处理重复 3 次。各浓度设置如下：腐霉利浓度为 0、01、05、10、20、50、60、80、100 ugml，代森锰锌浓度为 0、l、5、10、20、50、100、200 ugml。于 25培养 72 h 后，采用十字交叉法测定菌 落净生长量，然后分别计算出各浓度对菌丝生长的抑制率。用统计软件 DPS 处理，求出 EC50值(抑制中浓度)。同时可得出最低抑制浓度 MIC 和亚致死剂量。 以敏感基线为标准，测定番茄早疫病菌对 3 种杀菌剂的敏感性并计算待测菌株的抗性 系数，抗性系数小于 5 则为敏感菌株，大于 5 则为抗性菌株。相关公式如下：孢子萌发抑制率(%) = 100对照孢

9、子萌发率药剂处理孢子萌发率对照孢子萌发率-菌落净生长量=菌落直径一菌碟直径 抗性系数=待测菌株 EC50值相对敏感菌株 EC50值 17 抗性频率测定对抗性频率测定对 3 种药剂抗性频率的测定以最低抑制浓度(MIC)为标准。将待测菌株孢子悬浮液在含 嘧菌酯 10 ugml PDA 上萌发，将待测菌株菌块在含腐霉利 80ugml、代森锰锌 200ugml PDA 上培养，能萌发和生长的菌株则为对应药剂的抗性菌株。 1. 8 抗性菌株抗性水平测定将检测到的抗性菌株抗性菌株抗性水平测定将检测到的抗性菌株 分别接种在含系列浓度的含药平板上，测定不同分离菌株对这 3 种杀菌剂的敏感性， 具体测定方法同敏

10、感基线的测定。计算各抗性菌株的 EC，并与敏感基线进行比较，统 计抗性菌株的抗性水平。抗性倍数计算式为： 抗性倍数 = 抗性菌株 EC50敏感菌株 EC50 其中，抗性倍数小于 5，归属于敏感类型(S)；520 为低抗类型(RL)；20100 为中抗类型(RM)；大于 100 属于高抗类型(RH)。2 结果与分析结果与分析2. 1 菌株的分离与病原物确定菌株的分离与病原物确定 从浙江省 4 个调查地区共采集分离大概 100 株番茄早疫病菌菌株，分别从里中垅地区、 临安周围地区、农林大学官塘、余杭地区采集。采用分离纯化 100 株菌株确定是否可以使 番茄叶片发病。叶片被害症状，初呈深褐色或黑色圆

11、形至椭圆形的小斑点，逐渐扩大，达12 cm，边缘深褐色或黑色圆形至椭圆形的小斑点，逐渐扩大，达 12 cm，边缘深褐 色，中央灰褐色，有同心轮纹，边缘有黄色晕环。显微镜观察发病叶片上子实体的形态。 分生孢子梗单生或簇生，圆筒形，有 l 一 7 个隔膜，暗褐色，大小 40 一 90um68 um。分生孢子长棍棒状，顶端有细长的嘴胞，黄褐色，具纵横隔膜。所有这些特征与番 茄链格孢的特征一致。再由该试验的无伤接种，认定能引起发病的菌株即为番茄早疫病的 病原菌。 2. 2 敏感基线测定敏感基线测定 从表 1 中的数据可以计算得到所选带白哦菌株对腐霉利、代森锰锌及嘧菌酯的平均 EC50值。并以此作为番茄

12、早疫病对四种杀菌剂的相对敏感基线。表 1 里中垅地区早疫病对腐霉利及代森锰锌敏感基线菌株 独立回归方程 Y=a+bX 相关系数 95%置信限 EC50 平均 EC50 MIC 腐霉利 L2L6L27L28L29L35代森锰锌 L2L6L27L28L29L35嘧菌酯 L2L6LZ27L28L29L352. 3 敏感性测定结果敏感性测定结果临安、农林大学官塘、余杭三地番茄早疫病菌株对 3 种常用杀菌剂腐霉利、代森锰锌 及嘧菌酯的敏感性测定结果用表 24。.并从各表中可以初步计算得到番茄早疫病最三种药 剂的抗性水平。表 2 番茄早疫病对腐霉利的敏感性测定菌株 独立回归方程 Y=a+bX 相关系数 9

13、5%置信限 EC50 平均 EC50 MIC LA22LA20LA09 LA21G 18G 10G06YH20YH09YH21表 3 番茄早疫病对代森锰锌的敏感性测定菌株 独立回归方程 Y=a+bX 相关系数 95%置信限 EC50 平均 EC50 MIC LA22LA20LA09 LA21G 18G 10G06YH20YH09YH21表 4 番茄早疫病对嘧菌酯的敏感性测定 菌株 独立回归方程 Y=a+bX 相关系数 95%置信限 EC50 平均 EC50 MIC LA22LA20LA09 LA21G 18G 10G06YH20YH09YH212. 4 抗性菌株抗性水平测定抗性菌株抗性水平测定

14、 抗性菌株对代森锰锌有低抗、中抗、高抗 3 种表现型，由此可以统计出浙江省 3 地番 茄对于代森锰锌的敏感菌株水平分布。 表 6 浙江省番茄早疫病对代森锰锌的抗性水平分布敏感类型 抗性水平 菌株数量 /个 百分率 /个 SRLRMRH3 结果与讨论结果与讨论（1）实验试验研究中以从未用过任何杀菌剂的里中垅菌株对这 3 种杀菌剂的平均 EC50值作为相对敏感基线，所测地区的菌株与里中垅菌株相比，以此确定浙江省不同地 区番茄菌株对于三种常用药剂的抗性水平，从而确定某种药剂对于该地区的防治意义。（2）敏感性较高的药剂在生产实践中要慎重使用，并应注意采取综合防治，改变目前 植物病害主要依靠化学手段防治的错误做法。走综合防治的道路。通过对病害生物学的特 性、发生发展规律等的深入研究，从农业生态系统出发，创造不利于病害发生的生态环境， 尽可能减少病害的发生，当病害发生后，优先采用生物措施和农业措施，将化学防治作为 补救措施，非用不可时再合理科学地使用。就番茄早疫病而言，应以调节生态环境和生物 防治为主，以化学防治为辅的综合防治策略。以预防抗性的发生发展。