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1、1溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜结肠黏膜 I I B B 、IKKIKK 蛋白表达的作用蛋白表达的作用 唐立海，纪艳艳，杜 群，李燕舞，巫燕莉，柴玉娜，陈 昫，王汝俊（广州中医药大学脾胃研究所，广州 510405）摘要：目的摘要：目的 观察溃结灵对溃疡性结肠炎（UC）大鼠模型结肠黏膜核因子 B抑制蛋白-（IB）及 IB 激酶 （IKK）的蛋白表达作用，对其抗 UC 作用机制进行探讨。方方法法 采用三硝基苯磺酸（TNBS）法复制 UC 大鼠模型并进行不同剂量药物干预。采用Western blot 方法检测结肠黏膜 IB、 IKK 蛋白相对表达量。结果结果 模型组 IB蛋
2、白相对表达量明显低于正常组（P0.05）,溃结灵高剂量组 IB蛋白相对表达量显著高于模型组（P0.01）,中剂量组 IB蛋白相对表达量明显高于模型组（P0.05） ；模型组 IKK 蛋白相对表达量显著高于正常组（P0.01） ，溃结灵高、中剂量组 IKK 蛋白相对表达量均明显低于模型组（P0.05） 。 结论结论 溃结灵对 TNBS 法 UC 大鼠模型结肠黏膜 IB蛋白表达的上调作用及对 IKK 蛋白表达的抑制作用，可能是其抑制 NF-B 的活化，减轻炎症反应的作用机制之一。关键词关键词 溃结灵 溃疡性结肠炎 大鼠模型 IB IKKThe effect of Kuijieling decoct
3、ion on the protein expression of I I B B and IKKIKK in Colonic Mucosa of UlcerativeColitis Model RatsTANG Lihai，JI Yanyan，DU Qun， LI Yanwu，WU Yanli，Chai Yuna，Chen Xu， WANG Rujun， （Pi-Wei Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）Abstract：Objective To observe the effec
4、t of Kuijieling Decoction （KD）on protein expression of IB and IKKin colonic mucosa of rats with ulcerative colitis （UC）and to explore its possible mechanism. Methods Trinitro-benzene-sulfonic acid（TNBS）method was used for the establishment of UC rat model. After treatment with different dosages of K
5、D, Western blot technique were used to detect protein expression of IB and IKKin Colonic Mucosa. Results The relative expression of IB protein in model group was obviously lower than that in normal group（P0.05）, the relative expression of IB protein in high dosage group of KD was significantly highe
6、r than that in model group（P0.01）, the relative expression of IB protein in middle dosage group of KD was obviously higher than that in model group（P0.01）;The relative expression of IKKprotein in model group was significantly higher than that in normal group（P0.01） ，the relative expression of IKKpro
7、tein in both high and middle dosage groups of KD were significantly lower than that in model group（P0.05）.Conclusion The relative expression of IB protein is enhanced and the relative expression of 作者简介：唐立海（1983） ，男，博士研究生。通讯作者：杜群，研究员，研究方向：中西医结合中药 药理，Email: 。 *基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：30873421）2IKKprotei
8、n is Inhibited in colonic mucosa of UC model rats induced by TNBS after treatment with KD，Its possible mechanism may inhibit the activation of NF-B and reduce inflammatory reaction.Keywords： Kuijieling Decoction；Ulcerative colitis；Rat model；IB；IKK溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC)又称非特异性溃疡性结肠炎，可发生于任何年龄,与结
9、肠癌的发病有关，其发病机制复杂，常反复发作，治愈难度大1。核转录因子B（nuclear factor-B，NF-B）是与炎症反应、细胞增殖和凋亡等密切相关的转录因子，在细胞静息状态下与IB ( inhibitor of NF-B) 结合形成复合物，使NF-B滞留在胞质中呈非活性状态。当受到特异性激活剂的刺激时，IKK(IB kinase)被激活，使IB蛋白降解，NF-B从胞质转位至胞核从而调节多种基因的转录2,3。我们在多年临床实践的基础上，以清热健脾活血为治则，总结出溃结灵中药复方4，前期的研究表明溃结灵能明显抑制模型大鼠结肠组织NF-B的活化5。NF-B的激活涉及IB的降解，而后者有赖于I
10、KK的调控，IKKIBNF-B是一个有机联系的系统。因此本文采用Western blot法观察溃结灵对UC大鼠模型IB和IKK的蛋白表达的影响，探讨其抑制NF-B活化的作用机制。1 材料与方法材料与方法1.1 动物动物 SD 大鼠，SPF 级，雄性，体重 180-220g，广东省医学实验动物中心，合格证号：SCXK(粤)2008-0002。1.2 药物药物 溃结灵药材（救必应，白术，白芍，水蛭等）购于采芝林连锁药店，经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定，所购药材均符合中华人民共和国药典标准。按组方比例称取药材，常规方法制备水煎液。大鼠低、中、高剂量按成人用量的 5，10，20 倍计算，即含生药量
11、 4.6，9.2，18.3 g/kg，药物用蒸馏水配成 460、920、1830 g 生药/L。柳氮磺胺吡啶（SASP），批号：200906005，上海三维制药有限公司，用作阳性对照药物，大鼠取 10 倍成人用量即 0.5 g/kg，药物用蒸馏水配成 50 g/L。1.3 试剂与仪器试剂与仪器 三硝基苯磺酸（TNBS，美国 Sigma, 批号：021M5009）；Biovision mammalian cell Extraction kit 试剂盒（美国 Biovision，批号：50569）；凯基 BCA 蛋白含量检测试剂盒（凯基生物公司，货号：KGPBCA）；Bio-RAD 电泳仪（美国
12、Bio-RAD 公司，型号：164-5050）；Western Breeze（invitrogen 公司，批号：815192）；-actin 一抗（Santa Cruz 公司，批号：H1709）；IB一抗（Cell Signaling 公司，批号：4814S）；IKK 一抗（Cell Signaling 公司，批号：2370）；羊抗小鼠二抗（bioworld 公司，批号：315466）；羊抗兔二抗（bioworld 公司，批号：315398）；增强型 HRP-DAB 底物显色试剂盒（TIANGEN 公司，批号：J8303）；Bio-RAD 扫描仪（美国 Bio-RAD 公司，型号：GS-800
13、）。31.4 模型复制模型复制 采用 TNBS 灌肠法制作 UC 大鼠模型6。取 3 月龄 SD 大鼠，造模型前禁食 24 h，除部分大鼠作为正常对照组外，其余大鼠乙醚麻醉，用大鼠灌胃针头轻轻从肛门插入，深度为 8 cm，推入 TNBS 溶液（含 25 g/L TNBS 和体积分数 50 %乙醇）4 mL/kg 体重，捏紧肛门平放 5 min 即可，术后常规饲养。1.5 给药方法与标本留取给药方法与标本留取 造模后第 3 天，模型动物分为模型对照组，溃结灵低、中、高剂量组和阳性对照组，并按上述剂量给药，给药容积为 10 mL/kg。正常对照组及模型对照组给等容积蒸馏水，每天 1 次，连续 10
14、 d。末次给药 24 h 后，脱颈椎法处死大鼠，取距肛门8 cm 结肠，沿纵轴剪开，刮取肠黏膜组织，即置于液氮中速冻，转入-70 冰箱保存。1.6 IB和IKK蛋白表达 Biovision mammalian cell Extraction kit 试剂盒提取结肠黏膜全 细胞蛋白，蛋白定量用BCA法蛋白定量测定方法检测。蛋白样本变性后经SDS-PAGE电泳 （100g/泳道）、转膜及一抗4孵育过夜（-actin 1:500、IB 1:1000、IKK1:1000）， 二抗摇床孵育2h(HRP标记的羊抗小鼠二抗 1:2000，HRP标记的羊抗兔二抗1:2500)。DAB 显色后用光密度扫描仪对蛋
15、白含量进行密度分析，以目的蛋白与-actin的密度比值作为目 的蛋白的相对含量，并进行组间比较。1.7 统计学处理 应用 SPSS11.0 软件进行统计学处理，各组间均数比较采用单因素方差分析，以 P0.05 为差异具有统计学意义。2 结果结果 2.1 溃结灵对溃结灵对 UC 模型大鼠肠黏膜模型大鼠肠黏膜 IKK 蛋白表达的影响蛋白表达的影响 TNBS 法 UC 模型大鼠肠黏膜IKK 蛋白相对表达量显著高于正常组（P0.01） ，溃结灵高、中剂量组 IKK 蛋白相对表达量均明显低于模型组（P0.05） ，见表 1，图 1。表 1 溃结灵对 UC 大鼠结肠组织 IKK 蛋白表达的影响(s)x组别n剂量/gkg-1相对表达量正常组10-0.3450.091*模型组10-0.4990.123SASP 组100.50.3340.142*溃结灵高剂量组1018.30.3210.154*溃结灵中剂量组109.20.3630.145*溃结灵低剂量组104.60.4400.198注：与模型组比较，* P0.05，* * P0.0187KD 43KD 正常 模型 阳性 高 中 低图 1 IKK 蛋白表达条带图42.2 溃结灵对溃结灵对 UC 模型大鼠肠黏膜模型大鼠肠黏膜 I B 蛋白表达的影响蛋白表达的影响 TNBS 法 UC 模型大鼠肠黏膜IB蛋白相对表达量明显低于正
