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1、译文法国梧桐花粉主要变应原Pla a 1的提纯和鉴定背景：悬铃木，例如法国梧桐， 是分布于美国和西欧城市的一种重要的气传性变应原的来源。 目前对该花粉的相关变应原还知之甚少。本项研究的目的是识别法国梧桐花粉的相关变应原并提纯和鉴定分子量为18 kDa 的一种主要变应原蛋白质的特性。方法：使用离子交换、 凝胶过滤和反相色谱层析来分离法国梧桐花粉提取液。通过 EAST、SDS-PAGE、等电聚焦、免疫印迹和氨基酸测序进行分析。结果： 从法国梧桐花粉提取液中提纯得到分子量为18 kDa 的蛋白质，称为 Pla a 1。 这种未糖基化的蛋白质的等电点高于9.3，并且高达 92%法国梧桐花粉单一过敏患者
2、和 83%多敏患者对它过敏。对其N-末端序列分析产生的氨基酸序列，显示与资料库中已知的蛋白质没有同源性。与单一过敏患者反应的其他相关变应原蛋白质分子量为 43 和 52 kDa，与免疫球蛋白（ Ig）E 结合的普遍率分别为83%和 42%。肌动蛋白抑制蛋白（ Profilin ）则是多敏感患者的重要变应原。结论：已测定法国梧桐花粉的大多数相关变应原。对这种花粉特有的主要的变应原 Pla a 1已进行提纯和特性鉴定。关键词： 色谱层析法、法国梧桐、主要变应原、悬铃木、肌动蛋白抑制蛋白梧桐树或无花果树是广泛种植于美国和西欧的观赏树木，属于悬铃木属， 也称法国梧桐， 是一种在大多数西欧城市中最常见的
3、树木。在一些西欧国家， 花季时可检测到高浓度的这种花粉1-4，几乎达到西班牙马德里花粉总量的14%，1994年当地记录约有7.3 万棵法国梧桐5。尽管发现浓度很大，但是却认为法国梧桐是低致敏花粉。然而，最近在西班牙进行的研究显示皮肤点刺试验（SPT）法国梧桐花粉呈阳性的不同差异，范围从 5%至 56%，这取决于研究的地区5-6。虽然近几年来法国梧桐花粉在致敏反应中越来越重要，但是几乎没有报道过关于该花粉中与 IgE 反应的蛋白质的描述数据6-7。在本研究中，对导致单一过敏和多敏的梧桐花粉过敏患者产生花粉病症状的变应原进行了描述。而且，首次提纯了梧桐花粉主要变应原，并且阐述了它的生物化学性质和致
4、敏重要性。实验材料与方法患者患者表现为对 IgE 介导的法国梧桐花粉过敏8，相应地伴有季节性或常年性鼻炎、哮喘，或两者兼而有之的病史，与皮肤点刺试验强烈反应（西班牙毕尔巴鄂） ，并且产生法国梧桐花粉的特异性IgE 水平要比类似酶联过敏原吸附测试（EAST）高出两个级别。 12 名患者（ 5 名女性和 7 名男性患者，年龄为2550岁，平均年龄为 42 岁）法国梧桐花粉单一过敏。 18 名患者（6 名女性和 12 名男性患者，年龄为 1466 岁，平均年龄为 42 岁）法国梧桐过敏，也对其他花粉过敏，草和橄榄花粉就是最重要的种类。特异性IgE 水平通过 EAST（Hytec 系列特异性 IgE
5、酶免疫测定， Hycor 生物医学公司，德国卡塞尔）定量测得，如制造商所描述，将法国梧桐花粉提取液结合到纸盘上9。花粉粗提液的制备法国梧桐、黑麦草和油橄榄树的花粉粗提液如前所述制备10。用 Bradford法（考马斯亮蓝法）测定每种提取液的蛋白质浓度11。18kDa 的变应原的提纯和N 末端氨基酸分析离子交换层析法：法国梧桐花粉提取液过HiTrap SP 柱 （Amersham Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉）分离，在AKTA-prime蛋白质纯化设备（Amersham Pharmacia Biotech ） 中使用含 NaCl 0.3， 0.5 和 1.0M 的不连续梯度的
6、20mM pH6.0的磷酸缓冲液进行平衡。通过SDS-PAGE 电泳和专门与这种花粉反应的患者血清（图 1A，第二道）孵育进行免疫印迹来分析分离组分的致敏活性。凝胶过滤色谱层析法： 将集中的活性组分浓缩， 适用在葡萄糖凝胶Superdex 75 柱，在 SMART 设备（Amersham Pharmacia Biotech ）中使用含 NaCl 0.15M 的20mM pH8.0 的 Tris 缓冲液进行平衡。所有可分辨峰的组分分别集中，并进行SDS-PAGE免疫印迹分析。反相色谱层析法：集中的活性组分过RPC C2/C18 反相柱（ Amersham Pharmacia Biotech ）
7、，在 SMART 设备中使用含 0.1%三氟乙酸（ TFA）的 10-45%浓度梯度的乙腈。与阳性血清反应的组分经集中、透析、浓缩，保存于-20。依据埃德曼的降解技术，使用494 Procise蛋白质测序仪（ PE Biosystems，德国威特史丹特）对Pla a 1的 N 末端氨基酸进行测定。免疫检测和免疫印迹抑制实验蛋白质在还原12和非还原条件下进行SDS-PAGE 电泳分析，并经考马斯亮蓝 R250 染色显现出来。 分离的蛋白条带电泳转移到聚偏二氟乙烯上（PVDF 膜）13，在室温下用含有0.1%吐温-20 的 TBS 缓冲液封闭 1 小时。膜与过敏患者血清（用含 0.1%吐温-20
8、的 TBS 缓冲液 1:4 或 1:6 稀释）在 4下孵育过夜，然后与 IgE 多抗亲和素辣根过氧化物酶孵育，按照生产商的建议（ECL-Plus，Amersham Pharmacia Biotech ）通过化学发光的方法进行检测。免疫印迹抑制实验使用混合的患者血清进行。粗提液样品经SDS-PAGE 电泳分离并且如上所述电转移到膜上。在与膜接触前，混合的血清（用封闭液1:4或 1:6 稀释）与每种抑制剂或牛血清白蛋白（BSA）在 4下预孵育过夜。如前所述14-15，得到抗肌动蛋白抑制蛋白（Profilin ）Ole e 1和 Lol p 1 的单特异性兔抗血清。使用通常的色谱层析法纯化油橄榄树的
9、肌动蛋白抑制蛋白Ole e 1和 Lol p 115-17。琼脂糖等点聚焦在琼脂糖凝胶板（ FMC Bio Products，美国明尼苏达州罗克兰）上进行等点聚焦，pH 值为 3-10，分离的蛋白质由毛细管转印到PVDF 膜上18，室温下用含0.1%的吐温 -20 封闭 1 小时，如上所述进行孵育。 由此产生的电泳图谱在GS-710图像分析仪（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州里士满） 中进行图像分析。旋转异构酶法按照 Cadot 等人19描述的方法测定旋转异构酶活性。以在390nm 处吸光度的增加检测在 HEPES 缓冲液（35mmol/L，pH8.0）中糜蛋白酶（
10、2 -mol/l）对显色肽（琥珀酰丙氨酸丙氨酸脯氨酸苯丙氨酸对硝基苯胺，10mol/L ）的裂解速率。糖蛋白检测方法依照制造商的建议，使用DIG 多糖检测试剂盒（罗氏制药，德国曼海姆）测定用于印迹的纯化的18 kDa 蛋白质的糖蛋白。遵循供应商的说明书，使用Hi-Trap外源凝集素试剂盒（ Amersham Pharmacia Biotech ）鉴定 18 kDa蛋白质与不同琼脂糖耦合的外源凝集素的特异性结合。实验结果法国梧桐花粉过敏患者血清的IgE 活性在标准条件下用 PBS 提取法国梧桐花粉粗提液平均含有8.2%蛋白质。还原条件下进行花粉粗提液SDS-PAGE电泳后，由特异性IgE 免疫检
11、测分别测试30名法国梧桐花粉过敏患者的血清 （图 1） 。单一过敏和多敏患者显示出不同的IgE结合图谱。通过来源于单一过敏患者的血清，检测出法国梧桐花粉粗提液中主要变应原的表观分子量为15，18，43 和 58 kDa，普遍率分别为 16%，92%，83%和 42%。多敏患者血清显示了表观分子量为13，15，18，43，54-59 kDa的致敏组分，普遍率分别为50%，78%，83%，83%和 67%。图 1. 法国梧桐花粉粗提液的免疫球蛋白（Ig）E-免疫印迹分析。样品（ 4g 蛋白质）经 SDS-PAGE分离，电转移到 PVDF 膜，与法国梧桐花粉单一过敏（A）或多敏（ B）患者的单个血清
12、和非过敏患者（泳道C）的混合血清孵育。法国梧桐花粉的交叉反应进行酶联过敏原吸附测试抑制性实验来建立法国梧桐花粉提取液和黑麦草，油橄榄树、欧蓍草花粉之间的任何交叉反应。 在使用多敏患者的混合血清时，法国梧桐花粉提取液的IgE 活性被黑麦草和油橄榄树提取液部分抑制（图2A） 。法国梧桐花粉提取液与抗肌动蛋白抑制蛋白特异性多克隆抗体孵育表明梧桐花粉提取液中肌动蛋白抑制蛋白的存在分子量为15 kDa。使用特异性 Ole e 1-抗血清没有检测出相似于Ole e 1的蛋白质（未显示数据） 。正如预计的，单一过敏患者的混合血清没有表现出法国梧桐和黑麦草，油橄榄树、欧蓍草花粉提取液之间的交叉反应（图 2B）
13、 。图 2. （A-B）IgE-EAST 抑制性实验。与法国梧桐（） 、黑麦草（） 、油橄榄树（）和欧蓍草（）花粉提取液孵育后， 多敏患者（A）和单一过敏患者 （B）混合血清的 IgE 结合性的抑制。18 kDa 变应原的提纯法国梧桐花粉粗提取液经阳离子交换柱首先富集碱性蛋白，然后逐步洗脱（图 3A） 。 集中、 浓缩 0.3M NaCl 洗脱时出现的致敏组分， 过葡萄糖凝胶 Superdex 75 柱。分子量为 15-25 kDa 的致敏活性组分经反相色谱层析进一步提纯。使用这种方法可以得到7 个分辨峰，但是只有经40%乙腈洗脱产生的峰表现出致敏活性。在还原条件下分离蛋白质的SDS-PAGE
14、电泳结果得到分子量为18 kDa 的单一条带（图 3D） ，非还原条件下得到的电泳条带分子量为16 kDa （未显示数据）。纯化的 18 kDa 蛋白经凝胶过滤层析得到的表观分子量为183 kDa， 显示出该蛋白的单体性质。经分离的法国梧桐花粉变应原的最终含量为PBS 提取的蛋白的0.08%。根据 30 名过敏患者的血清得到的结果，因为超过50%的法国梧桐花粉过敏患者（ 87%）识别该蛋白，所以认为它是主要变应原，并且由世界卫生组织/国际免疫学会联合会变应原命名小组委员命名为Pla a 1 。图 3. 法国梧桐花粉提取液中Pla a 1的提纯。 （A）法国梧桐花粉提取液过HiTrap SP柱的
15、洗脱图。（B）IgE 活性组分过葡萄糖凝胶Superdex 75柱的洗脱图。（C）活性组分过 RPC C2/C18 反相柱的洗脱图。箭头表示IgE 活性组分。（D）法国梧桐花粉提取液经SDS-PAGE电泳分离蛋白（泳道 1） 、 过 HiTrap SP柱 （泳道 2） 、葡萄糖凝胶 Superdex 75柱（泳道 3） 、过 RPC C2/C18 反相柱（泳道 4）的活性组分的考马斯亮蓝染色图。泳道5 表明纯化蛋白的 IgE 免疫印迹结果。蛋白特性通过糖类与琼脂糖耦合的外源凝集素的结合能力判断其在Pla a 1中的存在，这些凝集素来源于麦芽、小扁豆、花生和刀豆，表现出对糖的不同亲和力。除了甘露
16、糖，葡萄糖，半乳糖或耦合到蛋白核心的N-乙酰葡萄糖氨基端外，被测试的凝集素没有结合上Pla a 1。按照轻度高碘酸钾处理，用商业试剂盒，进一步进行 Pla a 1印迹的糖蛋白检测，同样得到阴性结果。这些结果都表明Pla a 1不太可能是一种糖蛋白。进行反相色谱层析之前，部分纯化的Pla a 1 制剂用于测试旋转异构酶活性，但是未检测出旋转异构酶活性。得到的 Pla a 1高度纯化物以 12 个末端残基进行 N-末端氨基酸测序。氨基酸测序的结果是丙氨酸天冬氨酸异亮氨酸缬氨酸谷氨酰胺甘氨酸苏氨酸半胱氨酸赖氨酸赖氨酸缬氨酸丙氨酸（ADIVQGTCKKV A） 。该序列已经提交给 SWISS-PROT 数据库，注册号为P82817。与数据库中已知的其他蛋白质没有同源性。等电聚焦等电聚焦实验表明法国梧桐花粉提取液主要由等电点范围在4.0 至 5.5 的酸性蛋白和一条等电点高于9.3 的碱性条带组成 （图 4） 。用单一过敏患者的混合血清进行等电聚焦免疫检测，碱性条带
