生物化学实验指导(参考)1

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1、实验二、实验二、 紫外吸收法测定核酸的含量紫外吸收法测定核酸的含量一、 目的 1、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 2、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。 二、 原理 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系 统（CC 一 CC 一），能够强烈吸收 250280nm 波长的紫外光。核酸 （DNA，RNA）的最大紫外吸收值在 260nm 处。遵照 Lambert-Beer 定律，可以从 紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。 在不同 pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之 表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以

2、，在测定核酸物质 时均应在固定的 pH 溶液中进行。 核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以 （）来表示，即每升含 有一摩尔核酸磷的溶液在 260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。 核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的 pH 和离 子强度发生变化。它们的经典数值（pH = 7.0）如下： DNA 的 （）= 6 000 8 000 RNA 的 （）= 7 000 10 000 小牛胸腺 DNA 钠盐溶液（pH = 7.0）的 （）= 6 600，DNA 的含磷量为 9.2%，含 1g/mL DNA 钠盐的溶液光密度为 0.020。RNA 溶液（pH =

3、 7.0）的 （）= 7 7007 800，RNA 的含磷量为 9.5%，含 1g /mL RNA 溶液的光密 度为 0.0220.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在 260nm 波长下，浓度为 1g/mL 的 DNA 溶液其光密度为 0.020，而浓度为 1g/mL 的 RNA 溶液其光密度为 0.024。因此，测定未知浓度的 DNA（RNA）溶 液的光密度 OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。 该法简单、快速、灵敏度高，如核酸 3gmL 的含量即可测出。对于含有 微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若样品内 混杂有大量的上述吸收紫外光物质

4、，测定误差较大，应设法事先除去。 由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约 40，这就是众所周知的 增色效应（hyperchromic effect）。在大分子的核酸中，氢键和 -键相互作 用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度， 该现象称为减色效应（hypochromic effect）。 蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm 波长处， 在 260nm 处的吸收值仅为核酸的 110 或更低，因此对于含有微量蛋白质的核 酸样品，测定误差较小。RNA 的 260nm 与 280nm 吸收的比值.在 2.0 以上；DNA 的 260nm

5、与 280nm 吸收的比值则在 1.9 左右，当样品中蛋白质含量较高时，比 值下降。若样品内混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法 事先除去。 三、实验材料、主要仪器和试剂 （一）试剂 1标准核酸溶液（酵母 RNA 或小牛胸腺 DNA，用 0.01NaOH 溶液配制成500g/ml 溶液）2待测核酸样品 （二）器具 1、紫外分光光度计 2、微量注射器（50L） 3、移液管 3试剂 （1）5%6%氨水：用 25%30氨水稀释 5 倍。 （2）钼酸铵-过氯酸试剂：取 3.6mL70%过氯酸和 0.25g 钼酸铵溶于 96.4mL 蒸馏水中。 四、操作步骤 （一）核酸紫外吸收光谱的测定

6、 取 100L 的 RNA 溶液于试管中，加入 5 mL 蒸馏水，摇匀，测定核酸溶液 在 220290nm 波长范围的消光值，再用蒸馏水作空白调零。以该溶液在各波段 的光吸收值（即 A 值）为纵坐标，波长为横坐标，绘制核酸的吸收光谱。 （二）核酸溶液含量的测定 将上述测吸收光谱溶液的 A260直接计算溶液的 RNA 含量五、注意事项如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测 定时需加钼酸铵过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液 A 值作为 对照。 六、思考题 1采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？ 2若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？ 参考答案

7、 1用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优 点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生 较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则 会产生较大测定误差，需要设法事先除去。 2当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除 去大分子核酸，测定上清液 260 nm 处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂 测得的样品液 260nm 光密度中扣除。实验三实验三 植物体内过氧化氢酶活性的测定植物体内过氧化氢酶活性的测定一、目的一、目的过氧化氢酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关

8、A260系，故常加以测定。通过实验可了解过氧化氢酶的作用，并掌握测定过氧化氢酶活性的 原理和方法。二、原理二、原理过氧化氢酶把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，以一定时间内分解的过氧化氢量 来表示，当酶与底物（H2O2）反应结束后，用碘量法测定未分解的 H2O2量。以钼酸铵作 催化剂，使 H2O2与 KI 反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，其反应式为：H2O2 + 2KI + H2SO4 I2 + K2SO4 + 2H2O I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6根据空白和测定二者硫代硫酸钠滴定用量之差，即可求出过氧化氢酶分解 H2O2的量。三、三、 材料、仪器设备及试

9、剂材料、仪器设备及试剂1. 材料：材料：水稻叶、甘蔗叶及其他植物叶片。 2. 仪器设备：仪器设备：分析天平；恒温水浴；研钵；100ml 容量瓶；100ml 三角瓶；滴定管；滴 定管架；移液管；移液管架；漏斗；洗耳球等。 3. 试剂及配制试剂及配制1.8molL1H2SO4 10(NH4.)6MO7O4 0.02 molL1 Na2S2O3 20KI 1淀粉液 CaCO3粉 石英砂0.018H2O2溶液配制：溶液配制：吸取 30H2O2原液 0.3ml 至 50ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度， 摇匀后再稀释 10 倍。四、实验步骤四、实验步骤1. 过氧化氢酶的提取过氧化氢酶的提取 选取甘蔗功能叶

10、片，擦净去主脉剪成碎片，混匀后迅速称取 1g 放入经冷冻过的研钵中， 加少量 CaCO3粉末及石英砂，并加入 34ml 蒸馏水，在冰浴上研磨至匀浆，用蒸馏水将 匀浆通过漏斗洗入 100ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后过滤。然后再取滤液 10ml 至 100ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀即为酶稀释液。 2. 酶活性测定酶活性测定 2.1 取 100ml 容量瓶 4 个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液 10ml，立即向 3、4 号瓶 中加入 1.8molL1H2SO4 5ml 以终止酶活性，作为空白测定。 2.2 将各瓶放在 20水浴中保温 510min（若室温超过 20则以室温

11、为准） 。保温后向 各瓶准确加入 0.018H2O2 5ml, 摇匀并记录酶促反应开始时间。 2.3 将各瓶放在 20水浴中让酶与底物（H2O2）作用 5min。时间到后迅速取出，立即在 1、2 号瓶中加入 1.8molL1H2SO4 5ml 以终止酶活性。 2.4 向 4 个瓶中各加入 20KI 1ml 和 3 滴 10(NH4.)6MO7O4，摇匀，用 0.02 molL1 Na2S2O3 滴定至淡黄色后再加入 5 滴 1淀粉液作指示剂，再用 0.02 molL1 Na2S2O3滴定至蓝色 刚消失为滴定终点，记录 Na2S2O3用量。五、酶活性计算五、酶活性计算空白与样品两个重复滴定值取平

12、均值按下公式计算出过氧化氢酶活性：被分解 H2O2（mg）= 空白滴定值（ml）样品滴定值（ml） C 17.17被分解 H2O2（mg） 酶液稀释倍数 过氧化氢酶活性（mgH2O2g1Fwmin1）= 样品鲜重（g）酶促反应时间（min）公式中：C Na2S2O3量浓度17.17 H2O2摩尔质量21实验五实验五 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的一、实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术，了解电泳技术的基本原理，测定人血清中各种蛋白质的相对含量。二、实验原理二、实验原理醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。醋酸纤维素

13、薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小，厚度为 120。m醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：电泳后区带界限清晰；通电时间较短（二十分钟至一小时） ；它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。

14、 本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、 球蛋白、球蛋白、球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同（见下表） ，在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性 PH 缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在 PH8.6 的缓冲体系中电泳，染色后可显示 5 条区带。清蛋白泳动最快，其余依次是球蛋白（如图 1） 。12,醋酸纤维薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快

15、速等优点。根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类，pH 和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响，若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白电泳可选用 pH8.6 的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用 pH7.2 的磷酸 盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多物质必须经染色剂显色。醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光

16、密度测定。也可以浸于折射率为 1.474 的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。将血清样品点样于醋纤膜上，在 pH8.6 的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，CAM 经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、1、2、球蛋白 5 条区带，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。人血清中 5 种蛋白质的等电点及分子量蛋白质名称等电点（pI）分子量清蛋白球蛋白球蛋白球蛋白4.885.065.126.857.506900200 0001300 000290 000150 000156 000