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1、经过分级纯化的多糖在测定结构前须检查其纯度及测定分子量。 检查纯度最常用的判断方法： （1）用 G C 、HPLC 测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。 用不同的柱型测定结果更为可靠。（2）电泳只出现一条带。 如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳。对于中性多糖 可采用高压电泳，以硼酸盐为缓冲液，可增大其迁移速度。 （3）凝胶柱层析图呈现对称的单峰。若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好。 阴离子交换层析纯化 用 DEAE 一纤维素 52(2.6x100cm)柱层析,0.lmol/LNaCl 洗脱,流速 6ml/h,按 2ml 一管 分部收集,苯酚一硫酸法逐管检测,绘制收集
2、体积与糖含量之间的关系曲线。看是否有单一 对称峰。按照 Ye 等报道,采用 DEAE 一 52 一纤维素交换柱层析法(2.6x30cm)对鲍氏层孔菌菌丝 体粗多糖进行初步分离。DEAE 一纤维素凝胶预处理:称取 DEAE 一 52 一纤维素凝胶干粉,加 入约 10 倍体积质量比(ml/g)的 0.5mol/LNa0H 溶液浸泡 30 分钟,倒出上清液,用大量去离子 水反复浸洗至 pH 值近中性;再用相同体积的 0.5mol/LHCI 溶液浸泡 30 分钟,倒出上清液,用 大量去离子水反复浸洗至 pH 值近中性;最后用相同体积的 0.5mol/lNaOH 溶液再浸泡 30 分 钟,用大量去离子水
3、反复浸洗至 pH 值中性。处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水 0.5mol/LNaCl 溶液,去离子水依次分别平衡(流速 1.0ml/min)2 一 3 个柱体积备用. 糖样 100mg 溶于 5ml 的去离子水中,离心除去不溶物,上样于 DEAE 一 52 一纤维素阴离 子层析柱(2.6x30cm,Cl-1型),分别采用去离子水 0.1 和 0.3mol/LNaCI 溶液进行分段梯度洗 脱,流速 1.0ml/min,自动收集器分部收集(10ml/管),每梯度 20 管。用硫酸一苯酚法跟踪检 测各管多糖含量(490nm 处吸收值),以收集的管数为横坐标。吸光值(490nm)为纵坐标绘制 DE
4、AE 一 52 一纤维素色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同组分,50旋转蒸发浓缩,对 去离子水透析 48h 以去除 NaCI 及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得初步纯化产品。 初步纯化多糖得率计算公式: 多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量 x100% 葡聚糖凝胶层析纯化 采用 Sephadex G-100 凝胶层析法对 DEAE-52 一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品 进一步纯化。葡聚糖凝胶(sephadexG 一 100)的预处理:称取 sephadexG 一 100 凝胶干粉,加 入 30 倍体积质量比(ml/g )的去离子水,沸水浴 5 小时使其溶胀。冷却后用去离子水
5、反复浸 洗,减压脱气后进行湿法装柱,用 0.1MNa2SO4;溶液平衡(流速 0.25ml/min)2 一 3 个柱体积备 用。分别称取经 DEAE 一纤维素一 52 初步纯化的各多糖组分样品 20mg,溶于 2 ml 0.1 M Na2SO4溶液中,上样于 SephadexG 一 100 层析柱(2.6x60cm)用 0.1MNa2SO4溶液溶液洗脱,流 速 0.25 ml/min,分步收集(5ml/管)。用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量(490nm 处吸收值),以收集的管数为横坐标。吸 光值(490nm)为纵坐标绘制 sePhadexG 一 100 色谱柱洗脱曲线。依据洗脱峰型,合并相同
6、组 分,50旋转蒸发浓缩,对去离子水透析 48h 以去除 Na2SO4;及小分子杂质,最后将透析内液 冷冻干燥,得不同纯化产品。 纯化多糖得率计算公式: 纯化多糖得率(%)=纯化多糖质量/粗多糖质量 x100% （鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖） （4）纸层析法呈单一集中斑点。 取 0.5%的多糖样品溶液 50ul,点样于新华中速滤纸(3cmx20cm)距端点 1cm 处的中部,以 正丁醇:浓氨水:水(4O:50:5)为展开剂,饱和 2 小时以上,在室温下展开 6h,取出吹干,用 0.5%甲 苯胺蓝液染色,立即用 95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一个清晰的斑点。 （5）琼脂糖(Agarose)凝胶
7、电泳法 在琼脂糖板(厚度为 0.2cm)上点样 3 一 5ul 采用浓度为 0.075mol/L,pH8.6 的巴比妥缓 冲液,电泳 1-1.5h,电压为 64 一 80V,甲苯胺蓝(浓度为 1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸: 乙醇:水=0.1:5:5)脱色。多糖纯品经电泳展开后,看是否呈现单一斑点,斑点是否清晰。 （6）紫外分光光度法 将多糖 PWZ 加 0.9%NaCI 溶液溶解,配成浓度为 1mg/ml 的溶液,采用 UV 一 16OA 紫外可 见光谱仪扫描(200nm 一 30Onm)观察 260nm、280nm 处是否有吸收峰。 多糖的分子量测定： 过去用超速离心沉降法、光散射法、
8、渗透压法、粘度法等，这些方法操作复杂且误差 较大，现已少用。现在较常用的方法有凝胶过滤法和高效凝胶液相色谱法，这两种方法须 先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。一般来说，多糖结构分析包括以下几点： （1）单糖组成分析：研究确定单糖的种类及摩尔比； 完全酸水解后用高效液相色谱方法(HPLC)或气相色谱方法测定。 （2）糖苷键类型：研究确定糖苷键及支链点连接位置； 甲基化分析方法高碘酸氧化法与 Smith 降解法 （3）糖环大小：研究确定糖苷键为呋喃糖或吡喃糖；红外光谱 （4）异头碳构型：研究确定糖苷残基的 a-或 P-构型；2D NMR.(Two dimensional Nuclear
9、 Magnetic Resonance)光谱分析方法测 （5）确定单糖残基和重复单元的序列 甲基化分析方法与磁共振光谱分析方法结合分析，一般会参考多糖的单糖组成及摩尔 比信息以利于解析多糖结构。 高碘酸氧化法 薄层层析(TLc)定性， 气相色谱法 （6）取代基团位点：研究 0H-修饰基团的种类和取代位点，如 0-磷酸化，乙醜基取代，0-硫酷化等；比色分析方法 （7）多糖分子量分布的研究。 紫外光谱定性与定量方法 薄层层析：残基定性 气相色谱：残基定量 气质联用：残基定量 高效阴离子色谱法：残基定量 鉴定结构常用物理化学方法： 高效液相色谱:确定单糖组分和相对分子量 红外光谱分析:测定多糖的官能
10、团，不仅可以检测酮糖、酵糖的耻喃糖环或呋喃糖环的构象 和糖苷键的构型 核磁共振:-构型与 -构型残基的比例；判断异头碳构型；推断主链和支链连接键型 鉴定结构复合方法： 甲基化分析:推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例 高碘酸氧化法与 Smith 降解法:判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数 目 糖睛乙酸酷衍生物的气相色谱法:单糖组成和摩尔比各种多糖化学结构鉴定方法的具体实施方案 1、酸水解 （1）完全酸水解称 取 20mg 样品 , 加入 2mL 2molL-1的 H2SO4于安培管中沸水浴水解 8h, 水解液 用 BaCO3中和至 pH =7 , 离心 , 取上
11、清夜置冰箱冷藏备测 。 （阿魏侧耳子实体多糖分离 纯化及其化学结构的初步研究） （2）部分酸水解称取糖样 70mg，80条件下，0.05M 三氟乙酸水解 2h。降至室温后，离心 （4000r/min，10min） ，将沉淀干燥，留做 GC 分析。上清用无水乙醇除酸至中性(pH 为 67)，蒸馏水透析 48h：将袋外透析液浓缩，真空干燥，留做 GC 分析；袋内液浓缩至 5ml 左右，加 10 倍体积无水乙醇，醇沉过夜，离心(4000r/min，10min)，沉淀常规干燥， 作 GC 分析；上清浓缩， 真空干燥，留做 GC 分析。 2、高效液相色谱确定样品的单糖组成 色谱条件为 : 色谱柱为 Sh
12、odex KS804 Sugar(300mm 7.8mm) 柱温 40 度 流动相为水 流速 0.8mLmin-1 检测用 410R示差检测器，数据处理用 810GPC 软件进行。 同时用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖 8 种单糖进行对照, 根据峰值确定样品的单糖组成。 分子量的测定以标准分子量的葡聚糖 Pulluan 作分子量测定标准。让其通过高压液相 色谱柱, 条件同上, 先以分子量对数与对应的保留时间作标准曲线, 从标准葡聚糖 Pulluan 的工作曲线上可以求得该成分分子量 。 例如：（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究） 将水解后的多糖样品
13、 PW2 进行 HPLC 分析,结果如表所示:阿魏侧耳子实体多糖 PW2 经过 酸水解后,得到 2 种单糖:葡萄糖和半乳糖,摩尔比例 1.771。 例如： 经 HPLC 测定后对照标准曲线得多糖 PW2 的分子量为 3.18104。 （阿魏侧耳子实体多 糖分离纯化及其化学结构的初步研究）4、甲基化分析(1)基本原理先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，然后将多糖中的糖苷键进行完全 酸水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点。同时根 据不同甲基化单糖的比例，可以推测出此种连接键型在多糖重复结构中所占的比例。用此种方法得到的羟基及 NaBH4还原醛基后产生的羟基
14、，经乙酰化可得到甲基化的糖 醇乙酸酯(此产物易挥发，可进行 GC 分析)，再经 GC 与 GC-MS 分析，通过气相色谱的出峰 顺序和对质谱谱图的主要离子碎片的分析便可以较准确地确定糖的连接键型。反应通式如下:（2)甲基化反应取充分干燥的多糖样品 10 mg，溶解在 2.0 ml 的二甲基亚矾（DMSO)中。在 N2 保护 下快速加入干燥的 NaOH 粉 50 mg，用 N2排出空气，加盖密封，室温反应 1.0 h 并间歇振 荡。在 N2保护下缓慢滴加碘甲烷 1.0 ml，用 N2排出空气，加盖密封，室温继续反应 1.0 h 并间歇振荡，反应完成后加 0.5 ml 水终止反应。反应液先用自来水
15、流水透析 48 h，再用 蒸馏水透析 24 h，透析液冷冻干燥得第一次甲基化样品。第一次甲基化样品继续甲基化， 反应步骤同上，得第二次甲基化样品。如此重复甲基化三次。甲基化后的样品用红外光谱检测，3700 cm-13100 cm-1，附近无羟基的特征吸收峰，表明甲基化反应完全。 （3)甲基化样品的衍生化上述完全甲基化多糖样品加入 2 mol/1 的三氟乙酸(TFA ) 3.0 ml, 120密闭水解 2.0 h。冷却后 50减压蒸发干，加 2.0 ml 甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干得完全甲基 化多糖的水解产物。加蒸馏水 2.0 ml 使其溶解，再加硼氢化钠 25 mg，振荡后室温还原反
16、应 2.0 h。反应完后滴加 0.1 mol/1 醋酸分解过量的硼氢化钠并调 pH 值至 5.57.0 弱酸性。 反应液 50减压蒸发蒸干，加 2.0 ml 甲醇再蒸干，重复三次，最后蒸发干。上述蒸发干样品加入 1.0 ml 醋酸酐和 1.0 ml 吡啶，封管后在沸水浴中反应 1.0 h。反应 液 50减压蒸发干，加 2.0 ml 甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干。加入丙酮 1.0 ml， 用 0.45ul 尼龙微孔滤膜过滤，取样进行 GC/MS 分析。 (4)衍生化样品的 GC/MS 分析 多糖样品经甲基化、水解、还原、乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯，进行 GC/MS 联 机分析，根据文献的相对保留时间和不同单糖的主要离子碎片(m/e） ，推断出多糖样品中糖 基的连接方式及各种连接键型的比例。 本实验采用的条件为:GC ( Varian CP3800 型)和 MS （Varian Satum 2200 型)气相一质 谱联用仪，DB-5MS 石英毛细管柱(30 m X0.25 mm X0.25um);程序升温，初温 80，保持 1
