蛋白质的测定方法

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1、天津农学院天津农学院职业技术学院毕业论文职业技术学院毕业论文题目：有机酸的测定方法及其研究进展题目：有机酸的测定方法及其研究进展作者：曲洪双作者：曲洪双 系别：生物工程系系别：生物工程系班级：班级：0808 生物技术生物技术指导教师：童应凯指导教师：童应凯目录目录1.1.引言（前言）引言（前言）2.2. 蛋白质的总量的测定方法蛋白质的总量的测定方法2.12.1 半微量凯氏定氮法（水蒸气蒸馏法）半微量凯氏定氮法（水蒸气蒸馏法）2.22.2 双缩脲比色法双缩脲比色法2.32.3 紫外吸收法紫外吸收法2.42.4 考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法2.52.5 蛋白氮与非蛋白氮含量的测定蛋白氮与非蛋白

2、氮含量的测定2.62.6 FolinFolin酚试剂法酚试剂法 3 3蛋白氮与非蛋白氮含量的测定蛋白氮与非蛋白氮含量的测定3.13.1 游离游离 氨基氮的测定氨基氮的测定3.23.2 赖氨酸含量的测定赖氨酸含量的测定3.33.3 色酸氨含量的测定色酸氨含量的测定3.43.4 蛋氨酸含量的测定蛋氨酸含量的测定3.53.5 苯丙氨酸含量的测定苯丙氨酸含量的测定3.63.6 混合液中各种氨基酸含量的分离测定混合液中各种氨基酸含量的分离测定4 4 蛋白质分析的研究进展蛋白质分析的研究进展4.14.1 分光光度法分光光度法4.24.2 荧光光度法荧光光度法4.34.3 共振散射光度法共振散射光度法参考文

3、献参考文献蛋白质和氨基酸的测定方法与研究进展蛋白质和氨基酸的测定方法与研究进展摘要：综述了近年来蛋白质分析的研究进展，重点阐述了国内分光光度法、荧 光光度法以及共振瑞利散射光度法在蛋白质测定研究中的应用，探讨了相关领 域的研究发展趋势及方向。：综述了近年来蛋白质分析的研究进展，重点阐述 了国内分光光度法、荧光光度法以及共振瑞利散射光度法在蛋白质测定研究中 的应用，探讨了相关领域的研究发展趋势及方向。关键词：蛋白质、氨基酸 、测定原理、 分析方法、研究进展1 引言 蛋白质是生命物质的基础，是生命科学研究的其中主要内容之一，不同的 蛋白质种类具有不同的生物功能，它是由二十种 -氨基酸通过酰胺键 （

4、肽键） 特定联成的长链分子 （即所谓的肽链） 。部分蛋白质还以上包含非肽链结构的 其它组成成分，这种成分称为配基或辅基。蛋白质的元素组成除含碳、氢、氧、 氮和少量硫外，还含有微量的磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素。其中氮的含量 较恒定，平均为 16%。因此，一般可由测定生物样品中的氮，粗略地计算出其 中蛋白质的含量 （每 1g 氮相当于 6.25 克的蛋白质） 。蛋白质的基本组成单 位为氨基酸，构成天然蛋白质的氨基酸共约 20 种。除脯氨酸外，均为 -氨基 酸，即羧酸分子中 -碳原子上的一个氢原子被氨基取代而成的化合物。各种蛋 白质所含的氨基酸的数目和种类都各不相同。每一种天然的蛋白质都有自己特

5、有的空间结构，而这种空间结构通常称为蛋白质的构象1。为了表示蛋白质结 构的不同组织层次，科学家们采用了专门的术语：一级结构指组成蛋白质分子 的氨基酸的排列顺序。二级结构即多肽链的局部在一维空间上的排布 （构象） 关系，其中最常见的类型是 -螺旋和 -折叠片。三级结构指多肽链借助各种次 级键 （非共价键）盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象。如果蛋白质由一 条以上多肽链构成，称为四级结构，它涉及多肽亚基的空间排布和它们之间相 互作用的性质。蛋白质的种类繁多，结构复杂，迄今为止没有一个理想的分类 方法。近年来有些学者提出依据蛋白质的生物功能进行分类，把蛋白质分为酶、 运输蛋白质、营养和储存蛋白质、

6、收缩蛋白质或运动蛋白质、结构蛋白质和防 御蛋白质。据估计每个人大肠杆菌约有 3000 种不同结构的蛋白质分子，复杂 的人体则有 100000 种以上。正是依靠这些多种多样的蛋白质分子生物体才能 精确地完成某种复杂的生理功能。因此，蛋白质的定量分析在生命科学、临床 医学和食品分析等方面具有重要意义。本文综述近年来国内蛋白质分析研究的 某些进展，内容涉及分光光度法、荧光光度法、共振散射光度法测定蛋白质研 究的进展。 。测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。 2、蛋白质的总量的测定 蛋白质含量可以从它们的物理化学性质如折射率、相对密度、紫外吸收、染色 等测定而得知;或用化学方法如凯氏定氮、双缩尿反应、Fo

7、lin酚试剂反应等 方法来测定。其中，凯氏定氮法氏蛋白质定量的经典方法，但操作繁琐。Folin 酚试剂法和染色法氏一般实验室中经常使用的方法。这类方法操作简便、迅 速、不需要复杂好昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般测定较 为适宜。 2.1 半微量凯氏定氮法（水蒸气蒸馏法）2.1.1 样品与硫酸一同加热消化，含氮有机物即分解产生氨，氨与硫酸结合生 成硫酸铵留在溶液中。在定氮仪中，加入强碱碱化，使硫酸铵分解放出氨，借 水蒸气将氨蒸至硼酸溶液中，生成四硼酸按，用标准盐酸溶液滴定，即可求的 样品中总氮量，并换算出蛋白质含量。 消化：有机含氮物+H2SO4CO2+SO2+H20+NH32NH

8、3+H2SO4(NH4)2SO4 蒸馏：(NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3 吸收：2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O 滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3 2.1.2.试剂 (1) 浓硫酸过氧化氢水混合液（2+3+1） 在 100mL 水中缓慢加入浓硫酸 200mL 冷却后再加入 3%过氧化氢 300mL，混合备用。此液存放阴凉处可保存一 个月。 (2) 混合指示剂贮备液 取 50mL 1g/L 溴甲酚绿无水乙醇溶液与 200mL 1g/L 甲基红无水乙醇溶液混合，贮于棕色瓶中备用。 (3) 硼酸指示剂混合液

9、取 100mL 20g/L 硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液， 摇匀后溶液呈紫红色即可（约加 1mL 指示剂 0） 。 (4) 混合催化剂 硫酸铜（CuSO45H2O）10g，硫酸钾 100g，硒粉 0.2g,在研 钵中研细，使通过 40 目筛，混匀后备用。 (5) 0.01mol/L HCI 标准溶液。 (6) 400g/L NaOH 溶液。 2.1.3.测定步骤 消化：准确称取试样 0.20.3g(含有 1030mg 粗蛋白质)置入 100mL 凯氏烧杯 中，加混合催化剂 1g，同时加硫酸过氧化氢水混合液 35mL，稍加振摇， 斜置于电炉上，在通风橱内加热进行消化。开始时用低温加热，勿使瓶中

10、泡沫 超过瓶肚的三分之二，待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。消化到 溶液呈浅蓝绿色的透明状时，再继续加热沸腾 10min，取出，冷却至室温后， 将消化液转入 100mL 容量瓶中，用 7080mL 水洗涤凯氏烧杯，冷却至室温后加 水稀释至刻度，摇匀。同时作一空白，出不加试样外，其他操作相同。 蒸馏：在半微量凯氏定氮仪的蒸馏瓶中，加入 5mL 稀释消化液 10mL 水，再加入 10Ml400g/LNaOH 溶液，立即用水蒸气蒸馏，接收三角瓶中加 20mL 硼酸指示 剂混合液。待蒸馏瓶沸腾后蒸馏 5min。 滴定：用 0.01mol/LHCI 标准溶液滴定三角瓶中的吸收液，滴定至溶液由绿色

11、变 成浅紫红色为止。 吸取 5mL 空白消化液，按照上述操作步骤进行操作。 2.1.4. 计算粗蛋白质含量(干基，%)=(V-V0)c0.0140K1/m1001/(1-X) 式中 V滴定试样时消耗 HCl 标准溶液的体积(mL)；V0滴定空白时消耗 HCl 标准溶液的体积(mL)；cHCl 标准溶液的浓度(mol/L)；K氮换算成粗蛋白质的系数，一般取 6.25；M称取试样的质量(g)；X试样水分含量(%)；0.0140消耗 1mL1mol/LHCl 标准溶液相当于氮的质量(g)；2.1.5.讨论(1) 凯氏定氮法分常量、半微量和微量法三种，其原理和操作步骤基本相同。 所不同的是常量法适于测

12、定范围为 1540mg 氮，半微量法 25mg 氮，微量法 0.051mg 氮。另外，碱化后蒸馏，常量法采用直接蒸馏法，半微量法和微量 法采用水蒸气蒸馏法。(2) 消化过程中，若硫酸过氧化氢水混合液损失过多时，可酌量补加， 勿使瓶内干涸。消化液加水稀释后，应及时进行蒸馏，否则应保存消化液，临 用时加水稀释。(3) 蒸馏过程中切忌火力不稳，否则将发生倒吸现象。(4) 混合指示剂在 pH5.2 时为紫红色；PH5.4 时为暗灰色；pH5.6 时亮绿色， 变色点 pH5.4 指示剂变色范围很窄，灵敏度高。 2.2 双缩脲比色法 2.2.1 原理 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液

13、中蛋白质与 Cu2+ 形成紫色络合物，在 540mm 处有最大吸收。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比， 而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸成分无关。该法测定范围为 110mg 蛋白 质，适用于测定精度要求不高的样品。 2.2.2 试剂 (1) 双缩脲试剂 在 500mL 容量瓶中，依次加入 40g/L 硫酸铜溶液 30mL 和 25g/L 酒石酸钾钠溶液 100mL，再慢慢加入 5mol/LKOH 溶液 30mL，最后用水稀 释至刻度。 (2) 酪蛋白标准溶液 用 0.05mol/LNaOH 溶液配制成 20mg/mL 的酪蛋白标准 溶液。 2.2.3 操作步骤 绘制标准曲线：取 6 支试管，分别

14、加入 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 酪蛋白 标准溶液，并分别补水至 1mL。各加入 10mL 双缩脲试剂，摇匀，在 60恒温水 浴中显色 5min，于 550nm 波长下，以 0 号管为空白，测定吸光度。以蛋白质质 量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 样品处理与测定：准确称取固体样品 0.1000g（样品经粉碎后通过 40 目筛） ， 放入干燥的试管中，内放几粒玻璃珠，加入 1mL 水和 10mL 双缩脲试剂，在 60恒温水浴振荡器上震荡 5min，随后以 4000r/min 离心 10min。取上清液于 550nm 波长处以试剂空白为对照测定吸光度。从标准曲线

15、上查出相应的蛋白质 质量（mg） 。 液体试样：取 1mL 试液，加 10mL 双缩脲试剂，直接显色测定。 2.2.4 计算 蛋白质质量（%）=m1/10001/m100 式中 m由标准曲线查得酪氨酸的质量（mg）1000 mg 换算成 gm 试验称取质量（g） 2.2.5 讨论 (1) 对含脂肪高的样品溶液与双缩脲试剂混合后，若有雾状沉淀，需让其静 置 2h 以上再离心，取其清液比色。 （2） 显色反应受温度影响颇大，在常温（2025）下需 1h，40需 15min，60需 5min。显色后若出现浑浊，则离心后取清液比色测定。（3）双缩脲法常用于蛋白质的快速测定，低浓度的铵盐不干扰结果，Tr

16、is 及含氨基酸、多肽的缓冲液，以及蔗糖、甘油等干扰本实验。 （4）酪蛋白预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制溶液。 2.3 紫外吸收法 2.3.1 原理 蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在波长 280nm 处具有最大吸收峰。由于 各种蛋白质都含有酪氨酸，因此 280nm 处的光吸收是蛋白质的一种普通性质。 在一定程度上，蛋白质溶液在 280nm 处的吸光度与其浓度成正比，故可用作蛋 白质定量测定。核酸在紫外线区也有强吸收，可通过校正加以消除。 2.3.2 试剂 （1）60%碱性乙醇溶液 称取 NaOH2g，溶于少量 60%乙醇溶液中，然后用 60%乙 醇溶液稀释至 1000mL。 （2）300g/LNaOH 溶液。 2.3.3 测定步骤 准确称取粉碎并过 40 目筛的样品 0.5g，置研钵中，加少量石英砂和 300g/LNaOH 溶液 2.0mL，研磨 2min。再加 60%碱性乙醇溶液 3mL，研