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1、 CHRONO-LOG 560Ca 全血血小板聚集分析系统 操 作 手 册仅供体外诊断使用用于检测全血或富血小板血浆的血小板聚集和 ATP 释放，另外可以检测钙离子流。目 录总括与说明 血小板聚集实验的原理2 光学聚集法3 电阻法4 荧光释放法4系统特点5 电阻法5 一般特点5 操作说明6电阻法6 光学聚集法9 荧光法(ATP 释放)11 运行标准12 结果13电阻法13光学聚集法13 荧光法(ATP 释放)13 结果的解释14 筛选过程16样本要求16全面的过程19离子钙，形状改变和在含发光物质的血小板中的聚集31 药物干扰35 危险性35 保养与服务36 电子探针组件36 光路与隔膜36
2、自动定标过程37 典型聚集释放曲线附录总括与说明总括与说明血管损伤后，血小板粘附于血管的损伤处，聚集、合成前列腺素，释放 5-羟色氨、ADP、ATP 。前列腺素的合成与释放产物会引起更进一步的聚集。同时血浆凝固开始、凝血酶产生、纤维蛋白形成和血小板栓子堵塞损伤的血管。由于细胞膜糖蛋白、细胞内储存颗粒、血小板酶、血浆凝血因子缺乏常引起过量出血，人临床表现为：鼻衄、损伤、擦伤失血过多。另外,外科手术的患者尽管经常存在血小板功能障碍,但直到出血不止、或术后出血不止才能发现在 1962 年,Born 描述了用 ADP 诱导的血小板聚集并改革用比浊计测量富血小板血浆的聚集过程.这种改变包括:预温 37
3、度,搅拌和用记录笔记录一定时间内透过光的变化.在 1977 年，Feinman 设计了一台仪器,同时测量血小板聚集和 ATP 释放。这台仪器利用紫外光测量聚集,在聚集光路的右侧放置敏感的光度计，通过荧光的产生测量 ATP 的释放.在 1980 年，Cardinal 和 Flower 设计了电阻法测量全血中的聚集,非常小的电流通过两个电极,当电极刚与血接触时,在其表面会附着一层血小板,当聚集剂加入后,更多的血小板会聚集在其表面,引起电阻增加。电阻法的测量和荧光的测量又构成了一台全血荧光聚集仪。在 1984 年，Wojenski 和 Sliver 发现了一种快速的方法去进行常规实验室的操作。这种方
4、法就是同时测量聚集和 ATP 的释放,用血量为 5 毫升,30 分钟内完成检测。这种方法避免富血小板血浆的准备时间。在 1985 年 Johnson 创造了一种方法去检测洗涤血小板的钙流,这种方法有利于研究钙离子在血小板聚集中的作用。参考文献参考文献血小板聚集实验的原理众所周知，血小板必须在一系列条件和不同试剂存在的情况下才能发生聚集。 “血小 板聚集”是一个术语，用来表示血小板与血小板之间的粘附。在全血或富血小板血浆中 加入致聚剂，这种现象能被诱发。血小板的聚集有赖于钙离子、纤维蛋白原、单个或多 个的血浆因子和致聚剂的存在。使用不同种类和浓度的致聚剂，血小板的聚集也有不同 的变化。比如光学法
5、，ADP、肾上腺素、胶原、和瑞斯托霉素被广泛应用于监测和提供 最快速的基本诊断信息。 这些试剂的选择有其理论依据：ADP 和肾上腺素都包含在血小板的储存颗粒中，它 们在原始血栓形成时释放出来并诱发进一步的血小板聚集。所以体外的血小板和致聚剂 的反应被证明有助于确定出血性疾病的病因。另一方面，胶原虽然在血管的结缔组织中 而不在血小板中。但血管损伤后它被认为是第一个聚集或凝固前因子。因此，胶原血小 板的体外实验也是非常重要的。其他试剂如凝血酶、瑞斯托霉素、钙离子载 A23187、花 生四烯酸、凝血因子 VIII、血清胺也被用于血小板实验。 血小板聚集实验是目前最有用的血小板功能体外诊断实验。它能提
6、供其他技术不可 能或很难得到的结果，帮助疾病的诊断以及治疗措施的合理选择。这项实验累积起来的 经验描绘了先天和获得性血小板功能障碍的图谱。 血小板聚集实验的临床意义是获得性或类似性质的血小板功能缺陷的检测和诊断。加入特定的聚集试剂后，血小板是否聚集是区别不同类型的血小板功能障碍的依据。 如下表所示：血小板功能缺陷聚集的研究 缺陷ADP 诱导聚集胶原诱导聚集瑞氏托酶素诱导聚集 血小板无力症减少减少正常 血小板减少症正常（1 期）减少正常 假性血友病正常正常异常 非类固醇抗炎药正常（1 期）减少异常三种类型的聚集实验:PRP 中的光学聚集法全血中的电阻法ATP 释放（荧光）的检测光学聚集法光学聚集
7、法血小板的体外聚集可以反映血小板在体内形成初始凝血块的能力。 血浆悬液中的血小板通过相对低离心力的离心从经过抗凝处理的血液样本中分离。离心的产物称为富血小板血浆（PRP） 。贫血小板血浆（PPP）的制备是通过血液样本的 相对高速离心得到的。 Born 型聚集仪或光学聚集仪是一个带有一个（或多个）加热到 37 摄氏度样品室的 固定波长的分光光度计。同时进行持续的样品搅拌，因为在血小板和血小板的接触是决 定血小板体外聚集的必要因素。 Chrono-log 的样品室设计可以使一束红外线同时通过两个比色杯，一个盛有 PRP（样品）另一个盛有 PPP（对照） 。硅 photodiodes 检测可以通过样
8、品的光线：认为 的透光率是或者说是聚集；认为的透光率是或者说是 聚集。Photodiodes 检测到的透光率的变化量转化为仪器的记录。 双孔双红外线束的设计确保了重复性，并允许同时测量聚集和荧光。每个通道有一 个分离的孔用于检测（或洗脱的血小板；透光率）和校正对照（或缓 冲液；透光率）样品。光学聚集量和持续测量的检测样本和对照样本的透光率 变化是成比例的。揿下按钮设置好和透光率的基线。高灵敏度的双孔双光 束的检测系统，在检测样本和对照样本之间仅需的差异数即可检测。如果 样本不足以进行精确的检测，聚集输出量将在两条基线检测持续循环以警告操作者。 当血小板对刺激物（兴奋剂；聚集剂 ）产生应答而发生
9、变形时，其变大的体积使 PRP 的透光率降低：这将记录为样本的透光率相对于 PPP 降低。 如果聚集剂的剂量足够大可以引起血小板之间的黏附而形成聚集，越来越多的光线 可以通过 PRP 样本。透光随时间的改变被记录下来，其变化趋向于贫血小板血浆，即达 到 100%的透光率。 体外聚集记录表达的含义： 形状变化 第一波聚集（原始聚集） ，可能先背离 PRP 基线后再回到 PRP 基线。 不可逆的第二波聚集，发生在血小板未知颗粒成分变为刺激物并引发额外的聚 集。 聚集曲线还可以表明： 刺激物（聚集百分比）引起的透光率变化的最大值。 聚集的范围或速率，每分钟的聚集百分比变化 复合聚集剂和配剂常用于血小
10、板刺激。不同的聚集剂刺激血小板聚集的不同途径。 不同浓度的兴奋剂可以引出一系列曲线（剂量应答曲线） 。 这些检测组的应答模式与已建立好正常模式和异常模式做比较。普遍认为这些信息 与血小板凝血功能成分有关。全血中的电阻法全血中的电阻法血小板的体外聚集可以反映血小板在体内形成初始凝血块的能力。在抗凝血液中检测血小板，无需从血液中的其他组分中进行血小板分离。由于不需 要标本离心来得到光学上的透明细胞悬液，因而可以检测完整的血小板群体。减少 检测过程的耗时；血液中有形成分对血小板的影响也能表现出来。全血血小板聚集仪，要求样本加热到 37 度。要准备可重复使用的搅拌子后一次性搅 拌子。将搅拌子和样本一起
11、放到检测杯中。阻抗法聚集与光学法不同。电极要放到检测杯中用于检测。电极有两金属线。仪器 检测电极两个电线间的阻抗，而得到结果。在重要的平衡过程中，血小板以单层的形势在金属线暴露的部分，有一个稳定的阻 抗值。这个阻抗值为 0 ohm 时的值。当加入聚集试剂后，血小板聚集并包裹到金属线上。会增加电路中的阻抗值。电路 中阻抗的变化用 ohm 显示。加入试剂后仪器通常运行 4-6 分钟。电阻法的结果通常以下面的方式表示；在测试过程中的 ohm每分钟 ohm 的改变，即斜率。最大聚集率。 阻抗的变化直接表明血小板聚集的数量。瑞斯脱酶素诱导的聚集全血阻抗法较敏感。ATPATP 释放（荧光）的检测释放（荧光
12、）的检测ATP 的释放用的荧光检测方法。发光物的测量师是很简单的测量原理。但是大多数的可见光波长很并且很稳定，要求聚 集检测过程中的检测杯的透光度要好。后来都用荧光来检测，避免了可见光的干扰。通过加 CHRONO-LUME 试剂增强光通道对荧光的敏感。CHRONO 可同时检测血小板聚集和 ATP 的释放。光学法检测聚集通过光路的变化在纪录曲 线的改变。阻抗法可测全血或 PRP。系统特点系统特点电阻法电阻法电极探针：有根精密的金属丝组成探针有根足够长的电线，保证在水或生理盐 水的清洗过程中能得到简单的清洁标本量：总计ml，其中有 450ul 血450ul 生理盐水，100ulCHRONO-LUM
13、E 试剂反应杯：普通塑料 P/N367搅拌磁棒：eflon 涂层 P/N368 P/N367搅拌磁棒：disposable siliconizded P/N370系统的一般特点系统的一般特点搅拌速度:crystal 控制前方面板,每个通道能在 OFF 到 1200RPM 之间以 100RPM为一个单位调节 误差+/-1.0%温度:加热模块 37+/-0.2,电子控制,前方面板显示.另外可选购测定环境温度的组件.孵育位:36.5+/-1.0下,使用 1ml 反应杯,每个通道 6 个孵育位.电气要求:115 或 230V标本收集标本收集标本要求（全血）标本要求（全血）样本采集完成，要求静脉取样的位置损伤面积要小并且没有郁积。常用的诱导剂除了肾上腺素.血液标本用 3.2 或 3.8 的柠檬酸钠 1:9 抗凝。1 份抗凝剂 9 份全血。样本必须用含标准抗凝剂的真空无菌管收集。 测试肾上腺素的血液标本抗凝剂要求：在每毫升 1.5%的柠檬酸钠中加 2U/ML 的 HEP 混合 做抗凝剂。取 1 份抗凝剂 9 份全血。样本收集不需要禁食，但不能做剧烈运动。不能吸烟
