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1、乙酰胆碱受体,The Acetylcholine Receptor 林鑫,专业词汇,pharmacist n.配药者, 药剂师elucidate vt. 阐明, 说明curare n.箭毒马鞍子,箭毒(箭毒马鞍子的毒素,南美印地安人用以浸制毒箭)toxic adj.有毒的, 中毒的antagonistic adj.颉颃的vagus n.迷走神经Vagusstoff n.迷走神经释放物,acetylcholine (ACh) n.乙酰胆碱ray n.鳐potential prey 潜在的食物acetylcholinesterase n.乙酰胆碱酯酶motor nerves n.运动神经acety
2、lcholine receptor (nAChR) n.乙酰胆碱受体parasympathetic nerve 副交感神经synapses n.突触atropine n.阿托品,postsynaptic neurons n.突触后神经元bungarotoxin n.金环蛇毒素venom n.蛇毒homogenize vt.使均质 blender n. 搅拌机centrifuging n.离心过滤pellet n. 小球nonionic detergent非离子型洗涤剂hydrophobic adj.疏水性的hydrophilic adj.亲水的, 吸水的,phospholipid n.磷脂di
3、sruptive adj.使破裂的, 分裂性的carboxyl n.羧基resemblance n.相似之处affinity chromatography n.亲合色谱法(层析)pentamer n.五聚物electrophoresis n.电泳, 现象polyacrylamide gel n.聚丙烯酰胺凝胶,cation n.阳离子postulate n.假定conformational n.构象的inward flux 内流depolarization n.去极化sodium n.钠potassium n.钾mutagenesis n.诱变neurotransmitter n.神经递质,e
4、thane n.乙烷spray vt.喷射grid n. 格子, 栅格peripheral adj.外围的agrin n.集聚蛋白,集聚素由运动神经分泌并可诱 导肌纤维的乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体发生聚集axon n.轴突a cascade of events n.级联放大反应,in the vicinity of adv.在邻近phosphorylation n.磷酸化kinase n.激酶polymerization n.聚合sepharose beads n.琼脂糖凝胶珠affinity column n.亲和层析柱flaxedil n.三乙碘化三苯elute vt.洗脱,发现历程,19
5、c Claude Bernard:实验毒物及麻醉学说1906 John Langley:化学递质假说1921 Loewi:发现化学递质(ACh)1937 David Nachmansohn:发现nAChR的超级储存库(EO)19c70y 分离纯化nAChR19cL70y nAChR结构的揭示 nAChR的精细结构及其作用机理 1980s U.J. McMahan:agrin诱导聚集nAChR的机制,19c Claude Bernard:实验毒物及麻醉学说,伯纳尔 Bernard,Claude (18131878)。法国生理学家,生于隆恩(Rhne)圣瑞立安(StJulien)。在1843年,3
6、0岁的Claude Bernard已是一名药剂师并兼职一份很有前途的剧作家工作,但为了成为一名文学家的梦想,他离开了家乡,来到巴黎。但是,到巴黎后,一个偶然的机会使Bernard继续进修医学,并任法国大学(Collge deFrance)生理学教授马迪让(FMagendie)的助手,开始了研究生活。他的研究涉及到生理学的广泛领域,被后人认为是实验医学、普通生理学的创始人。,curare,curare是一种取自热带植物的 剧毒药物,被南美的土著猎人用 作制作毒箭的材料,因为它能麻 痹肌肉。Bernard发现 curare在麻痹骨胳肌的过程中,既不影响神经传导冲动到肌肉的能力,也不影响肌肉受到刺激
7、收缩的能力。于是,Bernard认为curare 的作用位点是神经与肌肉相接触的区域()。这一结论后来被John Langley 证实并进一步补充和完善。,1906 John Langley:化学递质假说,Langley 当时正在研究另一种植物提取物烟碱(nicotine)的特性。他发现nicotine 能刺激蛙的离体骨骼肌的收缩,但curare 会使nicotine 失效。在1906年,Langley提出:冲动从神经传递到肌肉,并不是借助于物理方法,就像电流在两根电线之间流过一样,而是一种特殊物质从神经末稍释放的结果。他把这一传递物称为化学递质,并认为化学递质通过与肌细胞表面的受体物质结合而
8、传导信号,就是在此位点结合了nicotine与curare。这些论断在后来被证明是很有远见的。,Langley的刺激通过神经释放化学物质传递到肌肉的假说在1921年被奥地利生理学家Otto Loewi的一个设计精巧的实验证明。,1921 Loewi:发现化学递质(ACh),化学家凯库勒(Friedrich August Kekul)在梦中悟出苯环的结构,是大众熟知的故事 。,灵感之梦,1864年的某个冬天,德国化学家凯库勒坐在壁炉前打了个瞌睡,原子和分子们开始在幻觉中跳舞,一条碳原子链像蛇一样咬住自己的尾巴,在他眼前旋转。猛然惊醒之后,凯库勒明白了苯分子是一个环就是现在充满了我们的有机化学教科
9、书的那个六角形的圈圈。这个最著名的例子并不是唯一。Loewi的精巧实验也源于梦。,1921年复活节星期天之前的那个夜晚,奥地利生物学家洛伊(Otto Loewi)从梦中醒来,打开灯,抓过一张纸迷迷糊糊地写了些东西,倒下去又睡着了。早上6点钟,他突然想到,自己昨夜记下了一些极其重要的东西,赶紧把那张纸拿来看,却怎么也看不明白自己写的是些什么鬼画符。幸运的是,第二天凌晨3点,逃走的新思想又回来了。,它是一个实验的设计方法,可以用来验证洛伊17年前提出的某个假说是否正确。洛伊赶紧起床,跑到实验室,杀掉了两只不幸的青蛙,取出蛙心泡在生理盐水里,其中一号带着迷走神经,二号不带。 用电极刺激第一号 心脏的
10、迷走神经使 心脏跳动变慢,几 分钟后把泡着它的 盐水移到二号心脏 所在的容器里,结 果二号心脏的跳动也放慢了。,这个实验表明,神经并不直接作用 于肌肉,而是通过释放化学物质来 起作用,一号心脏的迷走神经受刺 激时产生了某些物质,它们溶解在 盐水里,对二号心脏产生了作用。 Loewi把这种能抑制蛙的心脏跳动的物质称作“Vagusstoff” 。经过几年的研究,Loewi发现这种物质的化学及生理学性质与乙酰胆碱完全相同,于是他断定是迷走神经末稍释放的是乙酰胆碱(ACh) 。,神经冲动的化学传递就这样被发现了,它开启了一个全新的研究领域,并使洛伊获得1936年诺贝尔生理学或医学奖。,1937 Dav
11、id Nachmansohn:发现nAChR的超级储存库(EO),1937年,正当梭尔邦(Sorbonne)大学的神经生理学家David Nachmansohn参观巴黎世界博览会时,他注意到有几只具发电器官(electric organ, EO)的鳐正在表演节目。这些鳐的EO能够发出4060V的电压,杀死水中的潜在食物。,OE,发电器包括大量的电板(最高可达20 0万块),每一块电板来自一个特化的多核肌细胞,电板之间隔以胶状物质,许多电板包在一个结缔组织构成的小室内,神经通过结缔组织分支到每一电板。电鳐的电板呈垂直排列,放电的方向是由腹侧向背侧;电鳗的电板呈水平排列,放电的方向是由尾部向头部。
12、,当时Nachmansohn正在研究乙酰胆碱酯酶(AChase),AChase可酶解从运动神经末稍释放的ACh。Nachmansohn知道这类鱼的EO与骨骼肌是同源的,于是在博览会结束后,开始对EO进行研究。对EO的第一次实验结果表明它是AChase的超级储存库。此器官也是nAChR十分丰富的储存库,nAChR存在于骨骼肌细胞的突触后膜上,它会与由运动神经末稍释放的ACh分子结合。,如果能发现一个理想的系统模型,对于细胞结构和功能的特殊领域的研究,可以说是无价的。这将在后面的讨论中得以证实,鱼的发电器官事实上是nAChR研究中的唯一物质来源。,19c70y 分离纯化nAChR,Chen-Yan
13、 Lee:发现nAChR的理想标记物nAChR的分离纯化,-BGT:nAChR的理想标记物,由于nAChR是一种整合膜蛋白,直到19世纪70年代,才发展起了分离此类蛋白的技术。一种特殊蛋白的提纯需要一种与之亲和的标记物,来检测其在所分离的蛋白质片断中的纯度。作为nAChR的理想标记物的是能选择性的与其紧密结合的一种化合物。这种化合物被台湾立大学的Chen-Yuan Lee和他的同事们在1963年发现,是从台湾本土的一种毒蛇的毒液中提取出的,叫做-银环蛇毒素(-BGT)。-BGT通过与骨骼肌细胞突触后膜的nAChRs紧密结合,而阻碍ACh的传递,造成肌肉麻痹。,nAChR的分离纯化,在人们有-B
14、GT作为nAChR的标记物,EO作原料,以及一种溶解膜蛋白的去污剂之后,nAChR才得以在19世纪70年代分离。 在分离纯化的研究中,有一种方法是这样的:,得到含nAChR的细胞膜,先用搅拌器将EO的一部分制备成均一化的悬浮液,然后离心,使悬浮液中的质膜片断形成颗粒状物。,提取膜蛋白,经过许多溶解膜蛋白的尝试,最后发现TritonX-100的效果最佳。TritonX-100是一种非离子型去污剂。它与其他去污剂的相同点是都具有一个长的能取代膜蛋白上磷脂的疏水基团,以及一个能够溶解于水的亲水末端;不同的是大多数其它去污剂都带有一个带负电的羟基基团,而它没有,所以是非离子型的,对蛋白质结构的破坏性小
15、。于是,膜蛋白就可以用TritonX-100从质膜片断中提取出来。,分离纯化nAChR,将膜蛋白混合物灌注到装有人造复合物琼脂糖珠的层析柱中,这些琼脂糖珠的末端都带有一个ACh的结构类似物作为表面吸附剂。(Figure2a) 当这些膜蛋白流经层析柱时,两种与ACh有亲和位点的蛋白,nAChR和AChE,他们就被吸附在琼脂糖珠上。剩下约90的其它膜蛋白由于不能被吸附,直接流经层析柱。(Figure2b),再用10-3M的洗脱液flaxedil(三乙碘化三苯(-二乙氨乙氧基)洗脱,nAChR会被选择性地洗脱下来,并被收集,最后剩下AChE。采用这一方法后,用-BGT做标记物的检测结果表明,AChR
16、s在一步中被纯化了150多倍。这种方法就是亲和层析。,19cL70y nAChR结构的揭示,哥伦比亚大学的Arthur Karlin经过实验研究发现nAChR是一个五聚体,即一个由5个亚基组成的蛋白质。每一个受体都包含有2个亚基,、亚基各一个。亚基的分离提纯是在前面步骤的基础上,用聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术方法完成,主要是按各多肽(亚基)的大小将其分离。(Figure3),对nAChR的另一个具有里程碑意义的研究结果是证明了被提纯的受体蛋白除了有一个与ACh相结合的位点外,还具有一个阳离子通道。这个结论的假说已在此几年前,由巴黎巴斯德研究所的Jean-Pierre Changeux提出:当ACh与nAChR结合后,会使nAChR的构象发生改变,使离子通道开放。这样,由于细胞膜内外Na+离子的浓度差,导致Na+内流,膜去极化,骨骼肌收缩。,